脊椎动物发育过程中，胚胎轴线形成对于后续体轴发育及命运图谱建立至关重要。这一过程由组织中心
（Organizer）
严格控制，而母源β-catenin信号在其中扮演着核心角色。1924年，德国胚胎学家Hans Spemann和Hilde Mangold通过对蝾螈胚胎的移植实验，首次揭示了背侧组织中心的存在
【1】
。后续研究陆续在鸟类、小鼠和斑马鱼中发现组织中心决定胚胎体轴发育
【2-4】
。2018年，清华大学孟安明院士和陶庆华教授课题组联合发现了体轴决定因子Huluwa/Hwa（
Science突破丨孟安明/陶庆华组合作发现“葫芦娃”基因，解决早期胚胎发育重大问题—专家解读点评
）
（葫芦娃）
，其通过β-catenin信号通路调控胚胎体轴建立
【5】
。陈静教授当时作为共同一作，鉴定了
hwa
基因并阐明了主要信号转导通路。尽管关于Hwa蛋白的负向调控方式逐步被揭示，如溶酶体相关降解路径参与Hwa功能调控
【6, 7】
，然而Hwa/β-catenin信号通路的激活及下游信号转导机制尚不明确。
2024年11月19日，四川大学华西医院
陈静
教授团队在
Nature Communications
上发表了题为
A Huluwa phosphorylation switch regulates embryonic axis induction
的研究论文
【8】
。
该研究揭示了Hwa蛋白第168位丝氨酸（Ser168）磷酸化修饰在斑马鱼胚胎体轴建立中的关键作用，阐明了Hwa/β-catenin信号通路细胞膜上的磷酸化分子开关。
这一发现不仅深化了对Hwa蛋白本身的理解，更为早期胚胎发育信号调控互作提供了阐述，成为陈静团队在形态发生研究中的又一重要贡献。
Hwa是一个单次跨膜蛋白，N端胞外区较短，C端胞内区富含结构相对松散无序区段，具有一个相对保守PPNSP基序
（类似于Lrp5/6共受体的PPP(S/T)P基序）
。为探究Hwa蛋白的关键功能位点，研究团队首先利用
hwa
母源突变体
(M
hwa
tsu01sm/tsu01sm
)
的体轴挽救实验对候选位点进行筛选，发现Hwa蛋白Ser168位点对体轴诱导不可或缺，该位点的单氨基酸替代
（S168A）
将显著削弱Hwa蛋白的体轴诱导能力。而该位点定位于相对保守的PPNSP基序中，不同物种中Hwa同源蛋白对应位点突变都影响体轴诱导活性。在机制上，缺失或突变Ser168位点降低了Hwa与Tankyrase 1/2的结合亲和力，使Axin蛋白的降解受阻，从而阻碍了下游β-catenin信号通路的激活。
图1 Ser168对Hwa蛋白的体轴诱导活性不可或缺
（a）斑马鱼 Hwa 蛋白的结构域和基序组成。（b） 由不同 mRNA 挽救的
hwa
突变体胚胎的表型。（c） 根据 （b） 中的分类标准Hwa(163-170Aa) 不同位点突变 mRNAs 的体轴挽救效率统计结果。（d）Hwa蛋白及PPNSP基序在脊索动物中的保守性分析。(e) 文昌鱼（amphioxus）、海鞘（sea squirt）及蛙（frog）的野生型（WT）和 突变型mRNA的体轴挽救效果统计结果。
此外，研究团队通过LC-MS/MS鉴定了Ser168位点的磷酸化修饰，并发现多种激酶，如Cdk16、Cdk2和GSK3β等在体内
（
in vivo
）
和体外
（
in vitro
）
都能增强Ser168的磷酸化。激酶共表达将增强Hwa的轴诱导活性，而显性负效应Cdk16
DN
和pHwa
(Ser168)
抗体处理则会抑制Hwa蛋白的体轴诱导活性，这进一步论证了该位点磷酸化修饰在体轴诱导中的关键作用。
最后，研究团队利用CRISPR/Cas9结合ssDNA donor定点编辑技术，建立了单碱基编辑的hwa
S168A
突变体模型，M
hwa
S168A/S168A
突变体胚胎呈现体轴完全缺失的表型；与此同时，通过与
hwa
基因表达缺失突变体
hwa
tsu01sm
进行杂交获得的复合杂合胚胎
（M
hwa
S168A/tsu01sm
）
，也呈现体轴完全缺失表型。总之，通过严格的内源性遗传证据表明Ser168对斑马鱼胚胎体轴的形成至关重要。
(
a
) CRISPR/Cas9构建斑马鱼S168A突变体策略设计；(
b
) S168A纯合突变体基因型鉴定结果；(
c
) S168A纯合胚胎表现为体轴缺失的表型（可分为两个亚型）；(
d
) S168A纯合突变体中, 4 hpf和6 hpf组织中心及背侧命运基因（
boz、chd
和
gsc
）表达下调，腹侧命运基因（
vox、bmp2b
和
vent
）表达上调。
以上实验证据表明
Hwa蛋白Ser168位点对斑马鱼胚胎体轴发育不可或缺，其可被Cdk16、Cdk2和GSK3β等多种激酶磷酸化，充当Hwa/β-catenin信号通路激活的磷酸化分子开关。该研究提出了一个磷酸化精准调控模型，为解码脊椎动物胚胎体轴形成的分子机制提供了新视角，同时也为β-catenin信号通路的复杂调控网络增添了重要一环。
值得一提的是，今年正值Organizer发现100周年，该研究发现了Organizer关键调控蛋白Hwa的磷酸化分子开关，为我们对Organizer的理解提供了进一步的认识，这一工作的发表也是对Organizer世纪纪念的献礼致敬。展望未来，该研究团队认为Hwa蛋白磷酸化分子开关可能是一种普遍机制，为探究体轴诱导中的关键因子，以及细胞命运决定、其他激酶和发育冗余信号通路之间的相互作用提供了新的契机。
图3 Hwa的Ser168磷酸化分子开关调控Hwa/β-catenin信号通路激活
四川大学华西医院/华西临床医学院陈静教授为通讯作者，其研究生李瑶、严芸，以及康奈尔大学威尔医学院的青年学者龚波为共同第一作者。四川大学华西医院小儿外科研究室郑倩文、周海燕、孙佳睿、李明澎、王照、李垚辉、万芸婧、陈韦西等参与了该研究工作。
陈静课题组致力于形态发生的信号和机制研究，长期招收发育生物学、遗传学、分子/细胞生物学及生物信息学方向的博士后和研究生（非临床-学术型），欢迎感兴趣的同学投递简历。
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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-54450-4
制版人：十一
1. Spemann H, Mangold H. The induction of embryonic predispositions by implantation of organizers foreign to the species.
Arch Mikrosk Anat En
1924; 100:599-638.
2. Waddington CH. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.
J Exp Biol
1933; 10:38-U34.
3. Beddington RS. Induction of a second neural axis by the mouse node.
Development
1994; 120:613-620.
4. Shih J, Fraser SE. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage.
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1996; 122:1313-1322.
5. Yan L, Chen J, Zhu X, Sun J, Wu X, Shen W, Zhang W, Tao Q, Meng A. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates.
Science
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6. Zhu X, Wang P, Wei J, Li Y, Zhai J, Zheng T, Tao Q. Lysosomal degradation of the maternal dorsal determinant Hwa safeguards dorsal body axis formation.
EMBO Rep.
2021; 22(12):e53185.
7. Tejeda-Muñoz N, De Robertis EM. Lysosomes are required for early dorsal signaling in the
Xenopus
embryo.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A
. 2022; 119(17):e2201008119.
8. Li, Y., Yan, Y., Gong, B. et al. A Huluwa phosphorylation switch regulates embryonic axis induction.
Nat Commun
15, 10028 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54450-4
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