随着人口老龄化和运动损伤发生率上升，骨软骨缺损正成为全球关注的重大健康问题，对于软骨再生，需要大量新生成的软骨细胞，同时保持其表型。近几年来，
生物3D打印方法
因其在构建仿生组织方面的潜力而引起了广泛关注。
本期，EFL以
发表在杂志
《Interdisciplinary Materials》的“Three-dimensional bioprinting biphasic multicellular living scaffold facilitates osteochondral defect regeneration”
研究为例，
解析如何
利用生物3D打印技术制造双相载细胞的活性支架促进骨-软骨缺损修复与再生？
利用 3D 生物打印的优势，可以
准确地重现骨软骨组织的双层特性
，可采用由上层水凝胶和下层生物陶瓷或聚合物生物材料组成的仿生支架模拟骨软骨结构。甲基丙烯酰化明胶 (GelMA) 水凝胶具有优异的生物相容性、生物降解性和细胞黏附性能，是3D细胞培养的理想载体和用于增强组织再生的3D生物打印支架。大量研究已经证明了含锶 (Sr) 生物材料对骨再生的有益作用。之前的研究表明，用锶取代的硬硅钙石 (Sr-CSH ) 改性的 GelMA 生物墨水可以实现临界尺寸骨缺损的完全再生。
GelMA/Sr-CSH 可以作为双重调节生物墨水，同时调节软骨和骨再生
。
软骨层为装载关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞（ACs/BMSCs）的
甲基丙烯酰化明胶
（GelMA），软骨下骨层为装载BMSCs的GelMA/锶取代的硬硅钙石（Sr-CSH）。使用生物打印机打印，生物墨水（包含ACs/BMSCs或BMSCs）被装入注射器并在4°C下预胶化10分钟。打印过程中，注射器和接收板温度控制在15°C至20°C之间，打印压力为0.15–0.2 MPa，打印速度为8 mm/s。打印后，使用405 nm可见蓝光对支架进行交联60秒，并将其放入培养箱中培养。
（1）GelMA + ACs/BMSCs 3D 生物打印支架对软骨形成的影响
活/死染色结果证实 AC/BMSC 和 BMSC 的细胞存活率接近 100%。免疫荧光 (IF) 图像显示，GelMA + ACs/BMSCs 支架表现出更高水平的聚集蛋白聚糖和 Col-II 表达，qPCR结果显示，与 GelMA + BMSCs 组相比，GelMA/Sr-CSH 组的 SOX9、聚集蛋白聚糖和 Col-II 显著上调，聚集蛋白聚糖、 Col-II和SOX9 被认为是健康软骨细胞表达的典型标志物。总之，
GelMA + ACs/BMSCs 3D 生物打印支架适用于软骨再生
（图2）。
图2 关节软骨细胞 (AC) 和骨髓间充质干细胞 (BMSC) 共培养可增强体外软骨再生
（2）GelMA/Sr-CSH 3D生物打印支架对成骨分化的影响
与 GelMA 3D 生物打印支架相比，GelMA/Sr-CSH 3D 生物打印支架显示出
明显更深的 ALP 染色强度
。qPCR结果显示，与 GelMA 组相比，GelMA/Sr-CSH 组的 BMSC 中骨桥蛋白 (OPN)、骨钙素、骨涎蛋白、骨形态发生蛋白-2 (BMP-2) 和 runt 相关转录因子-2 显著上调。IF 结果显示，在嵌入 GelMA/Sr-CSH 支架内的 BMSC 中OPN 表达水平增加。此外，还通过茜素红S（ARS）染色评估了矿化形成情况，在GelMA组中，BMSCs周围几乎检测不到钙结节，相反，
在GelMA/Sr-CSH组中，钙结节更为明显，矿化程度更高（图3）。表明 GelMA/Sr-CSH 有效地包裹了 BMSCs 并促进其成骨分化。
（3）Sr-CSH纳米线释放的生物活性离子对AC和BMSC的双重调节
为了研究 Sr-CSH 纳米线对 AC 和 BMSC 细胞行为的影响，利用含有 Sr-CSH 纳米线的提取物来培养这些细胞。CCK-8结果表明，Sr-CSH 提取物促进了 AC 和 BMSC 的增殖。ALP 染色结果表明 Sr-CSH 调节 BMSC 的成骨分化，当在没有软骨诱导培养基的情况下在 Sr-CSH 提取物中培养 AC 时，软骨基质形成可被阿尔新蓝染色（图4）。综上所述综上所述，
Sr-CSH的双重调控作用有利于支架周围形成有利于骨和软骨再生的微环境，最终实现骨软骨的综合再生。
图4 Sr-CSH纳米线释放的生物活性离子对AC和BMSC的双重调节
（4）双相3D生物打印支架在体内修复关节软骨缺损的研究
在术后6周和12周，双相+细胞组（Biphasic+Cells）表现出最优的软骨再生效果，尤其是在6周时，新生软骨与正常软骨之间的界限不明显，软骨层结构接近天然软骨。GelMA+细胞组和Biphasic+细胞组的软骨修复相对较好，而空白组和GelMA组的修复不完全，缺损区域形成纤维组织。SO/FG染色进一步验证了Biphasic+细胞组的新生软骨结构与天然软骨相似。术后12周，所有组的缺损区域几乎被新生组织覆盖，Biphasic+细胞组的软骨层与正常软骨融合良好。组织学评分和ICRS评分进一步表明，
Biphasic+细胞组实现了最佳的软骨再生
（图5）。
术后6周和12周，空白组和GelMA组的骨再生有限，
而双相+细胞组显示出明显的新骨形成，且骨软骨界面重建较好
。定量分析表明，Biphasic+细胞组的骨体积（BV）和骨体积分数（BV/TV）显著高于其他组，
表明含Sr-CSH生物墨水的双相支架具有优异的成骨能力
（图6）。
图6 双相三维生物打印支架增强了软骨下骨再生并促进了体内骨软骨界面的重建
