Plus深读 | PRDM9提示H3K4me3在减数分裂中的新功能

原文链接：

http://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(18)30092-3

一般认为，在大部分细胞中，H3K4me3是启动子的标记。近年来，H3K4me3又被发现存在于过度活化态增强子，尤其是超级增强子上 ^[1] 。而在精母细胞中，H3K4me3则被发现可能参与减数第一次分裂的DNA双链断裂与同源重组过程。本文发现了 减数分裂特异性蛋白PRDM9可催化H3K4me3，使DNA双链断裂发生在正确的位置上，这一过程是酶活依赖的。

在减数第一次分裂的过程中，在染色体合适的位点上需要形成上百个DNA双链断裂（DSB），以保证同源染色体交叉互换，以及减数分裂的正常完成。这些断裂位点由减数分裂特异性蛋白PRDM9决定。它拥有锌指结构域可以结合DNA，同时又有甲基转移酶活性结构域PR/SET。但它的作用方式尚不清楚。

在本文中，来自法国蒙彼利埃大学的Frederic Baudat课题组与Bernard de Massy课题组合作，揭示了PRDM9可以在其结合位点形成H3K4me3和H3K36me3，进而形成DNA双链断裂，这些依赖于PRDM9的甲基转移酶活性。

PRDM9在两种小鼠品系中拥有不同的DNA结合位点。研究人员在小鼠中表达了可以结合在不同DNA位点的PRDM9变体，发现可以在对应的PRDM9结合位点形成H3K4me3和DNA双链断裂。突变酶活中心则导致H3K4me3和H3K36me3的下降，这些位点的DNA双链断裂不能形成。这说明PRDM9可以在其结合位点形成组蛋白修饰H3K4me3和H3K36me3，进而形成DNA双链断裂（图1）。

图 1 PRDM9可以在其结合位点形成H3K4me3和H3K36me3，进而形成DNA双链断裂。

在大部分的真核生物中，减数第一次分裂的一个标志性事件是同源染色体的交叉互换。在这个过程中，染色体首先被SPO11/TOPOVIBL复合物切割形成DNA双链断裂（DSB），然后发生同源重组修复。 ^[2-4] 在很多物种中，同源重组经常成簇地发生在一些高频位点，被称为同源重组热点。 ^{[3, 5]} 在人和小鼠中，同源重组热点被PRDM9决定。 ^[6-8] PRDM9是一种减数分裂特异性表达的赖氨酸甲基化酶，有PR/SET结构域（甲基转移酶活性结构域） ^[9] ，KRAB-related结构域，SSXRD结构域（调控蛋白互作） ^{[10, 11]} ，以及DNA结合结构域C2H2锌指结构域 ^[12] 。减数分裂的DSB受PRDM9调控，但具体机制尚不清楚。

PRDM9在B6小鼠和RJ2小鼠中拥有不同的变体，在B6小鼠中是 Prdm9 ^Dom2 ，在RJ2中是 Prdm9 ^Cst 。它们的锌指结构域不同，导致其结合在不同的基因组位点。这两个品系的同源重组热点也不同，并且没有明显的共定位。 ^{[13, 14]} PRDM9的这两个变体将会被研究者用来探究其结合位点、酶活与组蛋白修饰、同源重组热点的关系。

前人的体外实验表明，PRDM9可能具有催化H3K4me1/2/3，H3K36me1/2/3和H3K9me的活性。 ^{[12, 15-18]} 同时，在减数分裂前期的同源重组热点中也有H3K4me3和H3K36me3的富集。 ^{[14, 19-21]} 小鼠和人的PRDM9结构研究表明其PR/SET结构域和其他的SET结构域类似 ^[18] ，而且其Y357是关键的酶活中心。突变Y357会导致PRDM9酶活缺失。 ^{[18, 22]}

虽然减数分裂的同源重组热点的选择需要PRDM9，但在PRDM9缺失后，DSB水平并未下降 ^{[12, 23]} ，而是“错误地”定位到了非PRDM9依赖的H3K4me3位点，如启动子区和增强子区 ^[14] 。这表明促使DSB形成的蛋白可能同时识别H3K4me3和PRDM9，然后在正确的位置产生DSB。在PRDM9缺失后，DSB在错误的位点形成，精母细胞会停滞在减数第一次分裂中期，DSB不能正确修复。 ^{[12, 14, 23]}

在本文中，研究者构建了PRDM9酶活缺失的小鼠，并利用PRDM9的两个变体进行研究，证明了PRDM9的酶活对同源重组热点的H3K4me3和H3K36me3富集是必要的，对DSB的正确形成、减数分裂的正常进行也是必要的。

一． 构建小鼠模型

如前所述，PRDM9在B6小鼠和RJ2小鼠中拥有不同的变体，在B6小鼠中是 Prdm9 ^Dom2 ，在RJ2中是 Prdm9 ^Cst （如图2A）。它们的 锌指结构域不同 ，导致其 结合在不同的基因组位点 。因此，研究者就在B6小鼠中，利用BAC（细菌人工染色体）转入了 Prdm9 ^Cst 基因，命名为B6-Tg(WT) ^Tg/Tg ；或转入Y357F酶活突变的 Prdm9 ^Cst 基因，命名为B6-Tg(YF) ^Tg/Tg 。（Tg是transgene的意思，YF是Y357突变为F的意思）。这两株小鼠都是既表达内源 Prdm9 ^Dom2 ，又表达外源 Prdm9 ^Cst 的。由于PRDM9的这两个变体的DNA结合位点不同，且已有文献报道它们各自的结合位点；后面，研究者会关注 Prdm9 ^Cst 的结合位点上，WT和Y357F的区别。

此外，研究者还在敲除B6内源PRDM9的小鼠中，过表达了WT Prdm9 ^Cst 基因，或酶活突变体 Prdm9 ^Cst 基因，分别命名为 Prdm9 ^-/- Tg(WT) ^Tg/- 和 Prdm9 ^-/- Tg(YF) ^Tg/- 。

所有的小鼠株系，及其表达的内外源PRDM9的说明，如图2B所示。其表达PRDM9的mRNA情况如图2C所示（RT-PCR后的cDNA跑胶图）。表达PRDM9的蛋白量如图2D所示（用自制PRDM9抗体做的Western Blot）。可以看到PRDM9蛋白定位在核内。而PRDM9的抗体存在较多杂带。

图 2 实验所用小鼠模型的构建。

(A) Prdm9 ^Dom2 ， Prdm9 ^Cst 及酶活突变体 Prdm9 ^Cst-YF 的示意图。(B)各品系小鼠的内外源PRDM9表达情况。(C)四个品系的小鼠的Prdm9 RNA表达情况（cDNA RT-PCR产物跑胶图）。(D) C为胞质，N为细胞核。PRDM9标记：全长PRDM9应该在的位置；*标记：在B6和Tg(WT)Tg/Tg特有的条带，可能是WT PRDM9条带；△标记：Prdm9KO 特有的条带，可能是截断体PRDM9，或非特异条带；□标记：非特异条带。(E) 免疫荧光显示转基因Prdm9(WT)或Prdm9(YF)在精母细胞晚期细线期表达，定位在核内。(F) 各小鼠的PRDM9在细线期，偶线期，粗线期/类粗线期的表达量（免疫荧光检测PRDM9的信号，一个点是一个细胞核）。

在敲除Prdm9的小鼠中，转入Prdm9(WT)或Prdm9(YF)后，其蛋白在精母细胞晚期细线期表达，定位在染色质上（图2E, 2F）。

二． PRDM9的酶活对同源重组热点的H3K4me3和H3K36me3是必要的

研究者选取了B6小鼠的特异性同源重组位点A3和14a做ChIP-qPCR，检测到在B6小鼠中，以及B6小鼠转入 Prdm9 ^Cst (WT) Prdm9 ^Cst (YF)基因的品系中， 都有PRDM9的结合，以及H3K4me3和H3K36me3的信号 （因为它们都有B6内源 Prdm9 ^Dom2 ）。

另外，研究者又选取了RJ2小鼠的特异性同源重组位点Psmb9和Hlx1，ChIP-qPCR显示，B6小鼠中没有PRDM9的结合或H3K4me3，H3K36me3的信号。而在B6小鼠中转入RJ2小鼠的 Prdm9 ^Cst (WT)后，就有PRDM9的结合及H3K4me3，H3K36me3的信号。但转入酶活突变体 Prdm9 ^Cst (YF)后，虽然有PRDM9结合，却无H3K4me3，H3K36me3的信号。说明 Prdm9 ^Cst 的酶活对该位点的H3K4me3和H3K36me3是必要的 。（图3A, 3B, 3C）

为研究酶活突变体对同源重组效率的影响，研究者用DBA小鼠与B6或B6转基因鼠杂交，检测Psmb9位点的同源重组率，并以A3位点作为对照。发现转入的 Prdm9 ^Cst 的酶活确实对Psmb9位点的同源重组是必要的。（图3D）

图 3 同源重组位点的H3K4me3，H3K36me3和同源重组需要PRDM9酶活

三． PRDM9结合位点的DNA双链断裂需要PRDM9的酶活性

DMC1是在精母细胞同源重组过程中，介导DNA双链断裂（DSB）修复的一个关键蛋白。研究者用DMC1的结合位点（通过ChIP-seq）表示DSB位点。

在 RJ2小鼠的特异性DSB位点（ Prdm9 ^Cst 负责的位点） 上，在RJ2小鼠中有H3K4me3和DMC1的信号，而在B6小鼠中，则没有该信号（因为没有 Prdm9 ^Cst ，只有PRDM9 ^Dom ）。而当B6小鼠转入了 Prdm9 ^{C st} (WT) 后，这些位点就有了H3K4me3和DMC1信号产生。而转入 Prdm9 ^Cst (YF)则不会产生H3K4me3和DMC1信号。这证明 RJ2特异性DSB位点上，DSB需要 Prdm9 ^Cst 的酶活 。

而在B6特异性DSB位点（PRDM9 ^Dom 负责的位点）上，在B6小鼠中转入 Prdm9 ^Cst (WT)或 Prdm9 ^Cst (YF)，会引起H3K4me3及DMC1信号下降。（见图4）

图 4 PRDM9的酶活对DSB 位点的H3K4me3及DSB信号重要。(A)H3K4me3和DMC1的ChIP-seq track图，红色标记RJ2小鼠的特异性DSB位点（ Prdm9 ^Cst 负责的位点），蓝色标记B6特异性DSB位点（PRDM9 ^Dom 负责的位点），灰色标记Prdm9 KO小鼠的DSB位点。(B)上图为signal plot图，显示B6小鼠，及转入 Prdm9 ^Cst (WT)或 Prdm9 ^Cst (YF)后，在B6及RJ2同源重组热点上的H3K4me3和DMC1信号。下图为热图，显示三个株系小鼠在在B6及RJ2同源重组热点上的H3K4me3信号。

四． Prdm9 ^Cst 催化的H3K4me3会竞争 Prdm9 ^Dom2 负责的同源重组位点

研究者发现，当在B6小鼠中转入 Prdm9 ^Cst (WT)后，原本 PRDM9 ^Dom 负责的同源重组热点数量 减少了75% （以DMC1 ChIP-seq peaks标记），取而代之的是新产生了一万多个 Prdm9 ^Cst 负责的同源重组热点。总同源重组热点数仍保持一万四千多个。同时，原本 PRDM9 ^Dom 负责的 H3K4me3 信号也 下降 了，而在 Prdm9 ^Cst 负责的同源重组热点则 新产生了较强的H3K4me3 信号，强度约是前者的3.4倍。这表明 是PRDM9催化的H3K4me3介导了同源重组位点的选择 。

而在B6小鼠中转入 酶活突变 的 Prdm9 ^Cst (YF)后，则 几乎不会产生 Prdm9 ^Cst 负责的同源重组热点（只有53个）。PRDM9Dom负责的同源重组热点略微下降（下降一千多个），同时产生一千多个全新的同源重组热点。说明 Prdm9 ^Cst 负责的同源重组热点依赖于PRDM9酶活 。此外，转入酶活突变的PRDM9 Cst(YF)对内源PRDM9 ^Dom 有少量影响。（图5A）

为了进一步表明两种PRDM9变体催化的H3K4me3对同源重组热点的竞争作用，研究者又分析了三个小鼠株系的同源重组热点的DMC1信号与H3K4me3信号的相关性。作者发现，，在 PRDM9 ^Dom 负责的同源重组热点上，在B6小鼠中转入 Prdm9 ^Cst (WT)后，同等强度的H3K4me3不再能招募同等强度的DMC1（图5B），DMC1被 Prdm9 ^Cst (WT)催化的H3K4me3竞争过去了（图5C）。

图 5 PRDM9的酶活调控DSB位点的选择。(A)各小鼠株系的同源重组热点（用DMC1 ChIP-seq信号标记），及其与已被报道的 Prdm9 ^Dom2 ， Prdm9 ^Cst 及 Prdm9 ^-/- 同源重组位点的overlap情况；Shared： Prdm9 ^Dom2 与 Prdm9 ^Cst 共有的同源重组热点；New：与已报道的同源重组热点均不相同的新位点。(B)在PRDM9 ^Dom 负责的同源重组热点上，B6小鼠，及转入 Prdm9 ^Cst (WT)或 Prdm9 ^Cst (YF)后，DMC1和H3K4me3的信号比。(C)在B6小鼠中转入 Prdm9Cst (WT)后，在PRDM9 ^Dom 或 Prdm9 ^Cst 负责的同源重组热点上，DMC1和H3K4me3的信号比。

研究者通过PRDM9 ^Dom 和 Prdm9 ^Cst 催化的H3K4me3竞争DSB位点的现象，证明了 DSB的位点选择依赖于PRDM9催化的H3K4me3，并且确实是PRDM9酶活依赖的。

五． PRDM9的酶活性可阻止DSB发生在启动子上

2012年，Galina V. Petukhova课题组曾发现敲除PRDM9后，DMC1会错误地出现在H3K4me3标记的启动子等重要的基因组区域上，说明PRDM9可以调控DSB位点。

而本文中，研究者也发现 Prdm9 ^-/- B6小鼠的DMC1会跑到H3K4me3标记的启动子等重要的基因组区域上，而 Prdm9 ^{- /-} B6小鼠转入 Prdm9 ^Cst (WT)后，DMC1会分布在RJ2小鼠特异性的同源重组热点上。但 Prdm9 ^-/- B6小鼠转入酶活突变体 Prdm9 ^Cst (YF)后，DMC1还是在启动子上。这说明 PRDM9的酶活可阻止DSB发生在H3K4me3标记的启动子等重要的基因组区域上。 可能PRDM9和H3K4me3共同调控了DSB位点的选择。

六． 减数分裂前期的顺利完成需要PRDM9的酶活性

Prdm9 ^-/- 小鼠不育，其精母细胞、卵母细胞停留在减数分裂前期，DSB修复受损，同源染色体联会异常。而转入PRDM9 ^Cst (WT)后，雄性小鼠可产生单倍体精细胞，成体雌性小鼠也可产生卵子。而 Prdm9 ^{-/ -} 小鼠转入酶活突变体 Prdm9 ^Cst (YF)则不可。（图6A，图7）这说明 雌雄小鼠的减数分裂都需要PRDM9的酶活性 。

PRDM9的酶活性对于同源染色体的联会也是必要的。研究者在精母细胞的粗线期，用免疫荧光检测同源染色体的联会情况。SYCP3标记的是染色体，SYCP1标记的是联会复合物。研究者发现WT小鼠的常染色体，以及X Y染色体的同源区域，均可正常联会。而在 Prdm9 ^-/- 小鼠中，有很多常染色体都无法联会。而 转入 Prdm9 ^Cst (WT)后，联会恢复正常 。而 Prdm9 ^-/- 小鼠转入酶活突变体 Prdm9 ^{Cs t} (YF)则不可。（图6B，6D）

PRDM9的酶活性对于DSB修复也很重要。研究者用免疫荧光进行检测，SYCP3标记的是染色体，γH2FX标记DSB发生的位点。在WT小鼠中，γH2FX出现于细线期和偶线期，并随着联会的进行，逐渐消失。在粗线期，性染色体同源区域和常染色体上的γH2FX消失，γH2FX只在性染色体的非同源区域保留。而在 Prdm9 ^{-/ -} 小鼠中，γH2FX也是在细线期产生，但却持续地大面积出现在未联会的常染色体上，说明 在缺失PRDM9的情况下，未联会的常染色体可能无法修复DSB 。 Prdm9 ^-/- 小鼠转入 PRDM9 ^Cst (WT) 后， γH2FX信号恢复正常 。而转入 酶活突变体 Prdm9 ^Cst (YF)则不可 。（图6C）

研究者又用RPA标记未修复的DSB位点（RPA可结合DSB形成的单链DNA）。在WT小鼠和 Prdm9 ^{-/ -} PRDM9 ^Cst (WT)小鼠中，细线期和偶线期有200-300个RPA foci，然后在早期粗线期，RPA foci下降到150个，并逐渐消失。而在 Prdm9 ^-/- 小鼠和 Prdm9 ^-/- PRDM9 ^Cst (YF)小鼠中，RPA foci在细线期产生，在偶线期数量上升，在类粗线期（其精母细胞阻滞在该时期）数量仍多于WT及 Prdm9 ^-/- PRDM9 ^Cst (WT)小鼠。这说明 Prdm9 ^-/- 小鼠和 Prdm9 ^-/- PRDM9 ^Cst (YF)小鼠的DSB不能完成修复， DSB的修复需要PRDM9的酶活 。（图6C，6E）

图 6 减数分裂的完成需要PRDM9的酶活性。(A)7周龄（WT， Prdm 9 ^-/- ， Prdm9 ^-/- PRDM9 ^Cst (WT)小鼠）或9周龄 Prdm9 ^-/- PRDM9 ^Cst (YF)小鼠的希氏高碘酸染色结果。(B)和(C)：在粗线期或类粗线期的免疫荧光结果。(D)完全联会的染色体数目统计结果。(E)在细线期/早期偶线期，偶线期，粗线期/类粗线期的RPA foci的数量统计。

图 7 雌性小鼠的减数分裂也需要PRDM9的酶活性。(A)5周龄小鼠卵巢的苏木精-伊红染色结果。(B) 2-20周龄各小鼠株系的卵子数量统计。(C) 2-5周龄各小鼠株系的卵子数量统计。(D) 2-3周龄各小鼠株系的卵子数量统计。(E)各株系小鼠12dpp睾丸，E14.5、E15.5、E1 6.5卵巢的PRDM9 RNA表达情况（RT-PCR cDNA跑胶结果）。

七． 机制模型

最后，研究者提出了PRDM9参与DSB位点选择的机制模型： 在WT小鼠中，PRDM9结合特定位点的DNA，催化H3K4me3和H3K36me3形成，然后通过CXXC1蛋白招募DSB机器，在PRDM9结合位点附近发生DSB。 （2017年有研究组通过酵母双杂交，发现PRDM9与CXXC1和DSB机器IHO1互作。 ^{[24, 25]} ）而在PRDM9酶活缺失的小鼠中，PRDM9不能催化其结合位点的H3K4me3和H3K36me3形成，那么CXXC1及DSB机器可能会被招募到H3K4me3标记的启动子等区域上，引起DSB在错误的位点发生。该模型中，CXXC1被PRDM9结合位点或H3K4me3标记区域招募尚未被证明，是作者的猜想。（图8A）

研究者又构建了B6小鼠转入 Prdm9 ^Cst (WT)后， Prdm9 ^Dom2 与 Prdm9 ^Cst 竞争DSB位点的模型，如图8B所示。

图 8 PRDM9参与DSB位点选择的机制模型

综上所述，研究者揭示了 PRDM9可以在其结合位点形成H3K4me3和H3K36me3，进而形成DNA双链断裂，而且该过程依赖于PRDM9的甲基转移酶活性 。

延伸思考

1. PRDM9的两个变体可以结合在不同的DNA位点，在不同位点产生DSB。研究者很好地利用了这一点，在两种不同的位点上，结合酶活突变体展开机制研究。 本研究在体内证明了PRDM9的酶活确实对DSB位点的选择是重要的。 同时，也提示了 组蛋白修饰H3K4me3（或加上H3K36me3）在减数分裂中的不同的功能 。进一步的机制仍亟待发现。

   
   

2. 本文 对H3K36me3的研究较薄弱 ，无论是内源（ChIP-seq）还是外源（生化实验）都缺乏研究。

3. 本文所用的PRDM9为自制抗体，Western Blot表明其 特异性较差 。本文研究者未对PRDM9 ChIP-seq信号进行统计分析。该研究组2017年用它做的ChIP-seq结果显示，只有30%与同源重组热点overlap。 ^[20] 因此，虽然他们提出的机制模型可以自圆其说，其可信度仍打折扣。

   
   

4. 本文 未对PRDM9及其酶活突变体进行酶活生化研究 。前人的体外实验表明，PRDM9可能具有催化H3K4me1/2/3，H3K36me1/2/3和H3K9me的活性。 ^{[12, 15-18]} 但这些生化实验仍有不同程度的缺陷。

   
   

5. 是谁识别H3K4me3 or H3K36me3 ，介导了DSB？精细机制仍需研究。

   
   

6. PRDM9 KO小鼠中，DSB会发生在启动子的H3K4me3上，而WT小鼠中也有H3K4me3，却不会引起DSB。那么 PRDM9是如何与H3K4me3一起使DSB发生在正确的位置上的 ？

   
   

7. 本文没有统计分析 酶活突变的PRDM9是否 和WT PRDM9一样， 结合在DSB原本应该发生的位置上 。如果是的话，那么就可说明PRDM9蛋白本身并不能单独招募DSB机器，必须是PRDM9和H3K4me3在一起的时候才能招募。

   
   

8. 此外，也有可能是DSB机器首先 被H3K4me3+H3K36me3 （或者PRDM9催化了更多的修饰） 共同招募（不依赖PRDM9蛋白） ，当突变PRDM9酶活后，hotspots不再具备H3K4me3和H3K36me3信号，DSB机器才“退而求其次”选择只有H3K4me3的启动子。在启动子H3K4me3存在的情况下，只有H3K36me3的区域（如genebody）不能招募DSB机器。