Plus深读 | Nat. Genet. 揭示具有增强子功能的启动子---Epromoter

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https://www.nature.com/articles/ng.3884

在基因组上，基因的表达受到近端的启动子和远端的增强子共同调控。近年来，一些研究发现部分启动子可能具有增强子活性。为了在全基因组鉴别有增强子功能的启动子，来自法国Aix-Marseille大学的Salvatore Spicuglia课题组，利用体外报告系统筛选，结合体内CRISPR-Cas9，在小鼠和人类细胞中筛选鉴定出了一系列具有增强子功能的启动子，它们可激活远端的基因。该工作揭示了基因组上精细的转录调控过程，将有助于我们理解机体发育与疾病发生发展过程。

为鉴定出基因组上的增强子序列，Salvatore Spicuglia课题组此前开发了一项体外报告系统，叫做CapStarr-seq (Captured self-transcribing active regulatory region sequencing) ^{[1, 2]} ，如图1所示 ^{[3, 4]} 。

图 1 CapStarr-seq流程图

CapStarr-seq流程如下：

1. 研究者将基因组打断（本文用DNase I酶切基因组DNA，富集出的DNA即为染色质开放程度较高的DNA，即DHS，DNase I hypersensitivity sites）；

2. 合成< 150bp 的DNA 探针，用DNA microarray的方法，把打断的基因组杂交出来，作为待鉴定的增强子（图1a前两步）；

3. 构建报告质粒：利用增强子无论在基因的上游还是下游，均可激活靶基因转录的特性，将待鉴定的增强子放在报告基因的3’端，和报告基因GFP融合在一起（图1a第三步，图1b）。将质粒转染目的细胞。

4. 用流式细胞术分选出GFP高表达的细胞，进行RNA-seq。同时检测转染到细胞内的待鉴定增强子的DNA量。

5. 报告质粒会转录出GFP融合待鉴定增强子的RNA（图1C）。通过RNA-seq可以获知融合RNA的序列及丰度，将该丰度除以转染的DNA量，即可得知待鉴定的增强子是否具有增强子活性，是否可激活GFP表达，及其活性。

该方法的优点是： 可以大规模筛选、鉴定基因组中的增强子；用探针杂交的方法捕获待鉴定的增强子序列，节省了合成DNA的成本；待鉴定的增强子序列可以通过RNA-seq测到，因此不需要额外给每个增强子序列设计标签序列，节省人力物力。缺点是无法考虑体内染色质环境的影响。而且融合表达的增强子序列可能会影响RNA稳定性。

增强子研究的更多方法，欢迎点击： Plus深读 | Nature Biotech: 如何研究基因组中的非编码序列？

在本文中，研究者将小鼠T细胞系P5424的基因组切断，捕获DHS序列，分为两类：启动子近端序列（距离TSS < 1kb）和远端序列（距离TSS > 1kb）。构建报告质粒，转染小鼠T细胞系P5424和小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3，进行RNA-seq，比较来自T细胞系的两类DHS序列，在两种不同细胞内的增强子活性。

研究发现， 具有增强子活性的远端DHS序列具有更强的组织特异性， 而近端序列的组织特异性较弱。这体现在：来自T细胞的远端增强子上富集淋巴转录因子的结合（如ETS1，HEB），而近端序列则缺少这些转录因子的结合（图2a）；来自T细胞的远端序列更多地只在T细胞中具有增强子活性、在胚胎成纤维细胞中无增强子活性，而近端序列则更多地在两种细胞系中都有增强子活性（图2b-2d）。

图 2 具有增强子活性的远端DHS序列具有更强的组织特异性 | ( a )T细胞中的淋巴转录因子的ChIP-seq表明它们更富集在具有增强子活性的远端DHS序列上。( b ) 棕色部分是在两种细胞系中都有增强子活性的DHS，其中近端DHS的棕色比例高于远端DHS。( c,d ) 表明来自T细胞的DHS序列转入胚胎成纤维细胞后的增强子活性，仍然是远端序列弱于近端序列，表明远端序列的组织特异性更强。

研究还发现，具备增强子活性的近端DHS序列大多分布在TSS上游300bp至下游100bp，基本与核心启动子区重叠。因此，研究者把这些具备增强子活性的启动子称为Epromoter。下面，研究者将用该方法鉴定人源细胞K562和HeLa中的Epromoters，并研究其特征和功能。

研究者在ENCODE计划所用细胞系：人类髓性白血病细胞系K562和人类宫颈癌细胞系HeLa中筛选鉴定Epromoters。

他们将K562和HeLa细胞的基因组打断，捕获TSS -200bp至+50bp的DNA序列，进行CapStarr-seq。最终，他们在20719个启动子中，筛选到632个K562的Epromoters，以及493个HeLa的Epromoters，两者交集为146个。这些Epromoters与对照组启动子（基因有相同转录活性、非Epromoters的启动子）相比，CpG岛的比例无明显差别，物种间保守性也无明显差别。

研究者针对Epromoter的表观基因组进行分析，发现Epromoter有更高的p300（H3K27ac乙酰化酶）结合水平（图3a），更高的H3K4me1和H3K27ac水平（图3b）， 具备增强子的表观遗传学特征 。并且来自K562的Epromoter序列转染K562细胞的增强子活性要强于转染HeLa细胞，HeLa Epromoter也是转染HeLa更强（图3c），说明Epromoter还是具有一定的组织特异性的。

图 3（上）Epromoter具备增强子的表观遗传学特征

在HeLa中进行5’GRO-seq发现Epromoter有更高比例的反向转录（divergent transcription），这也是活跃的增强子的一个特征。

针对Epromoter近端基因进行GO聚类分析（图3d），发现其首先富集在一些基本生命过程相关的基因上（如肌动蛋白微丝相关基因，细胞代谢过程）。这和此前在果蝇的Starr-seq的结论相符， 一些持家基因的启动子可发挥增强子功能。 此外，K562和HeLa的Epromoter的富集通路也有 各自的独特性 。K562的Epromoter特异地富集在应激相关基因上，而HeLa的Epromoter特异地富集在I型和II型干扰素应答基因、病毒相关基因、病毒防御基因上。HeLa细胞确实高表达很多干扰素应答基因，而K562并没有，这可能是因为HeLa细胞来源于乳头瘤病毒感染的肿瘤细胞。此外，Epromoter还富集很多转录因子的motif（图3e），这也和增强子类似。

图 3（下）Epromoter具备增强子的表观遗传学特征 | (d) K562和HeLa的Epromoter近端基因的聚类分析。(e) K562和HeLa的Epromoter上富集的转录因子motif。

下面，研究者发现Epromoter近端基因的转录活性并不比非Epromoter更高（图4a）； K562或HeLa特异性的Epromoter近端基因的转录活性，在两种细胞系中也差不多（图4b），这表明Epromoter可能并不是近端基因的增强子。通过Pol II、H3K4me3、RAD21 ChIA-PET发现，Epromoter比非Epromoter在远端基因有更强的启动子-启动子相互作用（图4c）。这提示Epromoter是远端基因的增强子。

图 4 Epromoter的近端基因表达情况，以及启动子-启动子相互作用。

研究者以FAF2基因的Epromoter为例进行研究。他们用Pol II ChIA-PET发现该Epromoter与基因NOP16, CLTB 和RNF44的启动子有相互作用（图5a）。为了研究该Epromoter在体内是不是增强子，他们用CRISPR-cas9将该Epromoter切除，发现NOP16在Hela中的表达下降，RNF44在Hela及K562中的表达都下降（图5b）。这提示FAF2 Epromoter可能是RNF44的增强子。切除FAF2基因的Epromoter后，RNF44启动子的H3K27ac水平下降（图5c）。4C-seq也发现WT细胞的FAF2基因的Epromoter与RNF44启动子有互作，但切除Epromoter后互作消失（图5d）。最后，研究者又构建了体外luciferase报告系统，证明该Epromoter可以激活RNF44的启动子（图5e）。而如果切除RNF44的启动子，FAF2的表达不受影响（图5f），表明FAF2 Epromoter对RNF44的调控作用是单向的。

这些结果证明了FAF2基因的Epromoter是距其88kb处的RNF44基因的增强子。

图 5 FAF2基因的Epromoter是距其88kb处的RNF44基因的增强子

那么该Epromoter作为增强子时，有没有方向呢？为了解答这一问题，研究者将FAF2的Epromoter在基因组上翻转了过来，发现翻转后，RNF44的表达会下降（图6a），但还是高于Epromoter切除后的表达量（图6b）。这说明该Epromoter有一定方向性。

此外，过表达FAF2无法回复由于Epromoter切除或翻转引起的RNF44下调（图6b），证明RNF44并不是受FAF2基因调控的。

图 6 FAF2 Epromoter有一定的方向性

研究者利用ChIA-PET寻找Epromoter的靶基因（图7a），找到K562和HeLa的Epromoter的远端靶基因中，分别有18个和56个是干扰素调控基因（图7b）。

例如在K562中，SERPING1基因的Epromoter的远端靶基因是干扰素响应基因UBE2L6，METTL21A的远端靶基因是干扰素响应基因CCNYL1。这些干扰素响应基因在TNF-alpha的刺激下会被激活。但如果切除对应的Epromoter，UBE2L6和CCNYL1就不能在TNF-alpha的刺激下激活（图7c, 7d）。

这进一步证明了Epromoter对远端基因有顺式调控作用。

图 7 Epromoter可调控远端的干扰素响应基因

最后，研究者发现SNP可以影响Epromoter的活性，当把K562细胞的Epromoter的SNP突变，会导致Epromoter的靶基因的表达下调（图8）。这提示Epromoter中的疾病相关的SNP可能影响远端的基因表达，可能有助于我们更好地研究疾病的发生发展机制，

图 8 把K562细胞的Epromoter的SNP突变，会导致Epromoter的靶基因的表达下调

延伸思考

1.本研究通过高通量报告系统筛选了小鼠和人类细胞中，可能具有增强子功能，激活远端基因表达的启动子，将其命名为Epromoter。研究者鉴定了这些Epromoter的独特的基因组学和表观遗传学特征，以及SNP对其产生的影响， 证明了部分启动子可以作为增强子，以及CapStarr-seq可以很好地用于筛选增强子。 本研究揭示了基因组上精细的转录调控过程，将有助于我们理解机体发育与疾病发生发展过程。

2.本研究提示， 启动子可能存在成簇激活的情况。 这或许有利于转录机器更高效地完成转录。但值得注意的是，成簇激活的启动子可能并非互相激活。本文发现F2F Epromoter可以调控RNF44，但反之则不行。说明它们之间还是存在dominance的。此外，Epromoter调控的近端与远端基因，或许功能上存在联系，使得他们经常需要被一起激活，同时 这种成簇激活还存在上下游关系 。后续工作可以对其生物学功能展开更多研究。

3. lncRNA的启动子也有可能发挥增强子的作用 。2016年，Eric Lander 和 Eric Olson分别在Nature上发表的两篇论文，及Mitchell Weiss在Molecular Cell 发表的论文，都分别提出了这一设想 ^[5-7] 。如lncRNA linc1536/Bendr的启动子可以调控35kb外的基因Bend4的转录，lncRNA Uph的启动子也可以调控Hand2的表达。以前研究lncRNA的作用，经常采用 删除lncRNA（或其promoter）的做法 。这样看到的表型，其实 并不一定对应lncRNA作为RNA的功能 ，还有可能是其作为调控元件的作用，或其转录过程对其他基因的调控作用。所以，或许可以采用 antisense-oligo（ASO） 在核内敲低lncRNA来进行研究。此外，还可以rescue lncRNA（通过质粒，或者整合到基因组的其他位置产生核内lnRNA）作为对照。

（更多内容欢迎点击： 【Plus深读】lncRNA：不只是RNA——三篇重磅文章齐解读 ）

4.后期工作还可以研究Epromoter和远端启动子之间的 染色质高级结构如何被调控 ，与基因间区的经典增强子-启动子互作有何异同。

5.可以在DNA序列上分析Epromoter与基因间区的经典增强子的关系，推测增强子的起源机制（部分增强子也许源于启动子的复制、易位，Epromoter也许是比较原始的增强子模式）。

有关增强子的更多研究，可参考：

Plus深读 | Mol Cell: Mll3/4催化的H3K4me1对增强子活性不必要

Plus深读 | eRNA激活增强子的乙酰化？

【Plus深读】Nature Comm：原发性胃癌的超级增强子异质性分析

参考文献

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[4] ELKON R, AGAMI R. Characterization of noncoding regulatory DNA in the human genome[J]. Nat Biotechnol, 2017,35(8):732-746.

[5] ENGREITZ J M, HAINES J E, PEREZ E M, et al. Local regulation of gene expression by lncRNA promoters, transcription and splicing[J]. Nature, 2016,539(7629):452-455.

[6] ANDERSON K M, ANDERSON D M, MCANALLY J R, et al. Transcription of the non-coding RNA upperhand controls Hand2 expression and heart development[J]. Nature, 2016,539(7629):433-436.

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