第一作者说+Plus深读 | Nature首次揭示m6A调控造血干细胞命运决定

Graphical Abstract

背 景

血液系统是维持机体生命活动最重要的系统之一，能够为机体提供氧气和营养物质，通过物质交换维持内环境的稳态，同时还为机体提供免疫防御和保护。血细胞是血液的重要组成成分，所有成熟血细胞都起源于造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)，一群具有自我更新及分化潜能的多能干细胞。造血干细胞及各类血细胞产生、发育及成熟的过程称为造血过程，该过程起始于胚胎发育早期并贯穿整个生命过程，任一阶段出现问题都会导致血液疾病的发生。目前对于恶性血液疾病，如白血病，最常用的方法是造血干细胞移植，其治疗效果很大程度上依赖于移植细胞的质量及数量。因此体外诱导造血干细胞产生并维持其干性将成为非常重要的解决办法。研究体内造血干细胞的发育过程及其分子调控机制，能够为体外获得大量可移植的造血干细胞提供理论依据。

在脊椎动物中，造血干细胞最初产生于胚胎期主动脉-性腺-中肾区，由特化的生血内皮通过内皮-造血转化（EHT）过程生成，随后向胎肝（小鼠和人）或尾部造血组织（斑马鱼）迁移并进行扩增，向胸腺迁移以便发育为淋系细胞；最后，向骨髓（小鼠和人）或肾髓（斑马鱼）迁移以维持终生造血。经过几十年的研究与探索，人们对于造血干细胞的体内发育和体外诱导分化已有了基本的了解，但对整个过程的动态调控机制的认识仍不完善，尤其对于表观遗传修饰在脊椎动物造血干细胞发育过程中的作用更是知之甚少。

m⁶A（N6-甲基腺嘌呤）是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰形式之一。该修饰过程是动态可逆的，由甲基转移酶复合体（METTL3，WTAP和METTL14组成）、去甲基酶（FTO和ALKBH5）和相应的阅读器（YTHDF或YTHDC等）协同调控。目前，m⁶A的生物学功能已备受关注，并成为生命科学热门研究领域之一。Nature杂志连续发文报道了m⁶A在斑马鱼早期发育、果蝇性别决定以及T细胞稳态中的功能。自此，人们对于m⁶A修饰已经有了初步了解和认识，但是，该修饰的生物学功能以及其作用机制仍有待深入探索和挖掘。本研究团队前期的合作研究发现并鉴定了斑马鱼中m⁶A甲基转移酶复合体及其组分。在此基础上，合作团队研究人员进一步探索脊椎动物发育过程中m⁶A修饰的特点及功能，首次揭示了m⁶A甲基化修饰在脊椎动物造血干细胞命运决定中的关键作用。

文献解读

通过提取并纯化斑马鱼不同时期胚胎的mRNA，并采用高度灵敏的色谱质谱与多离子反应检测联用（ultra-high-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, coupled with multiple-reaction monitoring，UHPLC-MRM-MS/MS）等方法对mRNA中的m⁶A水平进行检测，发现在不同时期的胚胎中m⁶A都有相对较高的水平，这也暗示着m⁶A修饰在胚胎早期发育过程中发挥着重要作用。随后，我们提取并纯化斑马鱼28 hpf胚胎的mRNA进行meRIP-Seq。通过对m⁶A分布区域的序列进行分析发现，甲基化修饰位点的序列主要为GGAC（图1a），这与之前报道的哺乳动物的m⁶A分布序列高度保守。在mRNA中的m⁶A主要分布在编码区（coding sequence，CDS），终止密码子区（Stop Codon）和3’非翻译区（3’-Untranslated Regions，3’UTR）（图1b），这也与之前在哺乳动物细胞中检测到的分布特点一致。

为进一步探究m⁶A在斑马鱼胚胎发育中的功能，我们利用吗啉代寡聚核苷酸（morpholino, MO）敲低关键的甲基转移酶METTL3的编码基因mettl3，并对mettl3缺失胚胎进行了MeRIP-Seq。结果发现，在mettl3缺失胚胎中，m⁶A在5’UTR、CDS和3’UTR区域的分布都有明显下降（图1c）。将MeRIP-Seq进行分析并筛选后发现，4,593个基因中的m⁶A富集程度都有下降（图1d），我们将其选定为METTL3目标基因。随后我们对mettl3目标基因的功能聚类进行分析，发现除了之前报道的转录和翻译调控相关的基因条目之外，METTL3目标基因还聚集在胚胎发育中（图1e），暗示斑马鱼中的m⁶A修饰可能会调控胚胎发育过程。

图1. 斑马鱼胚胎mRNA的m⁶A甲基化组

为明确m⁶A甲基化修饰对胚胎发育的调控作用，我们首先对mettl3的表达进行了检测。结果发现，mettl3在血管内皮特异性表达，暗示着METTL3介导的m⁶A甲基化修饰可能对造血发育过程有调控作用。随后，我们对造血干细胞的产生进行了检测。原位杂交结果显示造血干细胞标记基因runx1和cmyb，以及分化的血细胞标记基因gata1（红系标记基因）、pu1（髓系标记基因）和rag1（淋系标记基因）的表达在mettl3缺失胚胎中有明显下降（图2a）。为了进一步研究这些造血表型是否是由于造血干细胞产生过程受阻，我们利用转基因鱼系Tg(flk1:mCherry;runx1-en-GFP)进行活体观察，其中GFP荧光标记内源runx1基因的表达，而runx1是造血干细胞的标记基因，因此在这种转基因鱼中造血干细胞呈现为GFP⁺，同时全身血管可以被标记为红色荧光（mCherry⁺）。生血内皮同时具有造血干细胞特性及内皮细胞特性，即呈现出GFP⁺ mCherry⁺表型（黄色）。结果发现，在mettl3缺失胚胎中生血内皮和新产生的造血干细胞数目以及胸腺中的T淋巴细胞数目都有显著下降（图2b和2c）。同时，通过实时拍摄发现，对照组胚胎的内皮细胞中有一些细胞发生特化形成生血内皮，随着胚胎发育，可以观察到内皮向造血细胞的转化过程。在此过程中，可以明显观察到血管内皮信号（mCherry荧光强度）的逐渐减弱，而造血细胞信号（GFP荧光强度）逐渐增强，直至细胞完全转变成造血干细胞（mCherry^-GFP⁺）（图2d）。然而，在mettl3缺失胚胎中却观察不到造血干细胞的产生，只有内皮信号的持续存在（图2d）。此外动脉内皮细胞的标记基因tbx20、hey2以及ephrinB2a表达在mettl3缺失胚胎中明显增强（图2e）。为进一步验证m⁶A在造血干细胞中的作用，我们利用CRISPR-Cas9技术构建了mettl3突变体斑马鱼。对突变体的表型分析，同样发现造血干细胞的产生被阻断。综上所述，m⁶A甲基化修饰在内皮造血转化过程能够调控内皮细胞和造血干细胞的命运。

图2. mettl3的缺失导致造血干细胞产生缺陷

为深入探索m⁶A甲基化修饰对造血干细胞产生的调控机制，我们利用转基因鱼系Tg(kdrl:mCherry;runx1-en-GFP) 分选出对照组和mettl3缺失组胚胎的内皮细胞（flk1⁺runx1^-），进行RNA-Seq。基因表达差异分析发现，METTL3目标基因中分别有462和680个基因在mettl3缺失胚胎中显著下调和上调（图3a）。对存在显著表达差异的基因进行GO分析发现，表达显著上调的基因有血管发育和信号通路转导等功能的高度富集（图3b），这一结果与之前检测的血管内皮基因表达升高相符。

结合m⁶A-Seq和RNA-Seq数据分析发现，notch1a mRNA中m⁶A peak数目和富集程度在mettl3缺失胚胎中都有非常显著的下降，而基因表达有明显上调（图3c）。因此，我们把notch1a作为候选靶基因。之前的文章报道，在内皮造血转化过程中，Notch信号通路能够通过维持内皮细胞的特性来抑制造血干细胞的产生，这一作用与我们在mettl3缺失胚胎中观察到的现象非常类似。因此我们猜测m⁶A是否可以通过直接对notch1a mRNA进行修饰从而通过Notch信号调控内皮细胞及造血干细胞的命运决定。

首先，我们对m⁶A是否能直接修饰notch1a mRNA进行验证。m⁶A-RIP-qPCR结果发现，在mettl3缺失胚胎中，notch1a mRNA m⁶A的富集下降至几乎检测不到的程度（图3d）。这一结果证明了notch1a mRNA可以直接被m⁶A修饰。随后我们在分选的内皮细胞中，通过qPCR检测notch1a基因的表达。同RNA-Seq结果一致，notch1a基因的表达在mettl3缺失胚胎中显著升高（图3e）。为证明notch1a基因的上调能够增强Notch信号，我们首先通过Western blot检测了Notch1蛋白水平的表达，发现在mettl3缺失胚胎中有明显上调，同时，具有活性的Notch1胞内段（NICD）的蛋白水平也明显上调（图3f）。随后，我们还利用Notch信号的转基因鱼报告系Tg(fli1a:EGFP;tp1-dsRed)来检测Notch信号的活性。共聚焦荧光显微镜观察结果显示，Notch信号激活的内皮细胞数目在mettl3缺失胚胎中有显著上调（图3g和3h）。为进一步验证m⁶A甲基化修饰对内皮细胞和造血干细胞命运的决定作用是通过Notch信号来介导的，我们利用Notch信号的特异性抑制剂DBZ以及notch1a MO来进行回救实验。结果发现，在mettl3缺失胚胎中降低的runx1的表达能够被DBZ处理或notch1a MO回救（图3i）。以上结果说明过度激活的Notch信号能够介导mettl3缺失所导致的内皮和造血干细胞缺陷的表型。

图3. METTL3介导的m⁶A修饰通过抑制notch1a mRNA来调控造血干细胞产生

接下来我们对m⁶A抑制notch1a表达的分子机制进行了探索。经过m⁶A甲基化修饰的mRNA可以被不同的“读码器”识别并走向不同的命运，其中YTHDF2能够介导m⁶A甲基化mRNA的降解，因此也暗示着其可能在m⁶A对notch1a的抑制过程中发挥作用。为证明这一猜测，我们首先确认了ythdf2缺失能够导致造血干细胞产生缺陷（图4b和4c）。随后，我们将已报道的YTHDF2对m⁶A的识别位点进行突变，通过在细胞内的表达最终得到斑马鱼的YTHDF2-MU突变蛋白（含W445A、W499A和W504A三个点突变）。EMSA实验结果表明，相比于野生型YTHDF2蛋白，突变YTHDF2丧失了对m⁶A的识别及结合能力（图4a）。同时，在ythdf2缺失胚胎中的造血干细胞缺陷表型可以被ythdf2 mRNA过表达回救，但是不能被ythdf2-mumRNA过表达回救（图4b和4c）。以上结果说明YTHDF2对造血干细胞的调控作用依赖于其对m⁶A的识别。

为进一步证明YTHDF2对m⁶A所修饰目标基因的调控作用，我们进行了YTHDF2-RIP-Seq。结果发现在YTHDF2结合的RNA中有72.3%的基因同样能够被m⁶A修饰，进一步说明YTHDF2对m⁶A修饰RNA的特异性结合。随后我们从对照组和ythdf2缺失组Tg(kdrl:mCherry;runx1-en-GFP)胚胎中分选出内皮细胞并对其进行深度转录组测序。相关性分析发现，在m⁶A和YTHDF2共同的靶基因中，有包括notch1a在内的472个基因在mettl3和ythdf2缺失的胚胎中表达都有上调，说明它们是m⁶A和YTHDF2的共同目标基因。GO分析发现这些表达上调的基因主要富集在信号通路和血管发育中（图4d），这与我们之前对m⁶A靶基因的分析结果一致。接下来我们分析了YTHDF2对notch1a mRNA的结合。结果发现在m⁶A结合的位置也有YTHDF2的结合，而且RNA-Seq也发现notch1a在ythdf2缺失的胚胎中表达明显上调（图4e）。

为进一步证明YTHDF2对notch1a的调控作用，我们在分选的内皮细胞中通过qPCR检测notch1a基因的表达。同RNA-Seq结果相同，notch1a基因的表达在ythdf2缺失胚胎中显著升高（图4f）。同时，Western blot检测结果显示Notch1蛋白水平的表达在ythdf2缺失胚胎中有明显上调（图4g）。随后，我们还利用Notch信号的转基因鱼报告系Tg(fli1a:EGFP;tp1-dsRed)来检测Notch信号的活性。共聚焦荧光显微镜观察结果显示，Notch信号激活的内皮细胞数目在ythdf2缺失胚胎中有显著上调（图4h和4i）。为阐明YTHDF2调控notch1a表达是否是通过其介导的mRNA降解途径，我们利用转录抑制剂actinomycin D从24 hpf开始处理对照组和ythdf2缺失组胚胎，并分别在处理后4小时、8小时提取RNA进行qPCR检测。结果显示，相比于对照组中actinomycin D处理后notch1 mRNA的快速降解，我们发现在mettl3或ythdf2缺失胚胎中，notch1a mRNA在actinomycin D处理后能够维持较高水平（图4j）。为进一步阐明YTHDF2对notch1 mRNA稳定性的调控依赖于其特定位点的m⁶A甲基化修饰，我们进行了单碱基分辨率的m⁶A-miCLIP-Seq，并发现notch1a mRNA上存在功能性的m⁶A修饰位点，并可以介导造血干细胞的表型。由此可知，YTHDF2能够通过促进mRNA降解来抑制notch1a的表达，进而调控造血干细胞的产生。

图4. YTHDF2介导的mRNA稳定性参与m⁶A对Notch信号的调控

总结