意外或外科手术（例如清创术和肿瘤切除术）可造成皮肤、脂肪、肌肉、皮瓣或联合性软组织损伤，从而导致大体积软组织缺损。修复重建大体积软组织的治疗方法通常为自体皮瓣移植、自体脂肪移植和假体植入。然而，这些治疗方法引发严重的并发症。目前，尚缺乏可以完美地治疗大体积软组织缺损的支架材料。因此，设计修复重建大体积软组织缺损支架的策略仍然是组织工程领域中亟需解决的瓶颈问题，凸显了研发可定制粘弹性生物材料的重要性。
日前，陕西科技大学陈咏梅、张慧洁团队在国家重点研发计划政府间专项重点项目(2022YFE0104200)的支持下，创新性的开发了一种简便方式合成的可定制壳聚糖微纤维基水海绵凝胶。这一方法构建的可定制壳聚糖微纤维基水海绵凝胶具有高度多孔结构和优异的持水性。通过剪切诱导壳聚糖微纤维以及冷冻处理和环氧开环反应交联，制备得到的水海绵凝胶在低应变下表现出水凝胶的粘弹性，在高应变下表现出海绵的可重复压缩回复性能，并具有与软组织（1 Pa-100 kPa）相当的模量（17.1 kPa-32.4 kPa）。其多孔结构（20-40 μm）中可以容纳大量的水(壳聚糖重量的2000倍)。水在大应变下，水可以快速挤出并产生显著的体积收缩，压力释放后可以重新吸收水并迅速自恢复(~1 s)至初始形状。此外，通过注射器挤出壳聚糖微纤维悬浮液可获得不同形状的二维和三维可定制结构（如正方形、三角形、蛛网形、正方体），这一特性有利于壳聚糖微纤维水海绵凝胶满足大规模制备各种复杂的结构需求。该工作以“Customizable hydrospongel based on chitosan microfibers”发表在《Journal of Colloid and Interface Science》上，刘珍秀研究生为第一作者，陈咏梅教授、张慧洁副教授为通讯作者。作者利用高速均质剪切方式将壳聚糖微纤维剪切重组，在环氧开环反应交联和冷冻交联过程中来构建水海绵凝胶。在高速均质化过程中，壳聚糖高分子链首先可以通过剪切再生自组装，在大剪切力下形成微纤维。此外，在冷冻条件下形成的冰晶聚集了分散的壳聚糖微纤维，并通过氢键将它们紧密连接，诱导了壳聚糖微纤维的二次自组装。同时，作为一种化学交联剂，环氧化物在碱性条件下可以发生环氧开环反应，与壳聚糖分子链上的氨基反应形成醚键，交联壳聚糖微纤维。为了分析交联剂化学结构对水海绵凝胶性能的影响，使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）和X射线衍射（XRD）表征。FTIR证实了壳聚糖微纤维可以与不同的环氧交联剂交联形成化学网络。XPS显示了环氧交联剂会影响壳聚糖微纤维上氨基的反应效率。XRD证实了交联剂不会影响壳聚糖微纤维的结晶。图1 CMFs基水海绵凝胶的合成路线和主要特性。(a)制备含有不同交联剂的水海绵凝胶。(b)壳聚糖微纤维基水海绵凝胶挤出水的照片以及扫描电镜和孔隙分布频率。(c)壳聚糖混悬液的可挤出特性。(d)皮下植入组织示意图。图2 壳聚糖微纤维水海绵凝胶的制备。（a）化学反应以及交联特征的示意图。(b) XRD、(bcFTIR光谱、水海绵凝胶的(d)O 1s和(e)N 1s。通过动态频率扫描实验分析了环氧交联剂对水海绵凝胶流变性能的影响。在整个频率范围(0.1 rad/s-100 rad/s)内，G′始终高于G′′，表明水海绵凝胶是稳定的弹性固体。具有不同环氧交联剂交联的水海绵凝胶以及纯壳聚糖微纤维水海绵凝胶都可以在90%大应变压缩下而不会被压碎。此外壳聚糖微纤维水海绵凝胶的杨氏模量范围为17.0 kPa至32.4 kPa，与软组织(1 Pa~100 kPa)相似。杨氏模量的变化受交联剂影响的水海绵凝胶用G'表示。G'随着环氧交联剂脂肪烃链长度和环氧官能团数量的增加而增加。丙三醇三缩水甘油醚水海绵凝胶的最大杨氏模量为32.4 kPa，具有三个官能团环氧官能团的丙三醇三缩水甘油醚与壳聚糖微纤维的交联效率最高，可以提高水海绵凝胶的力学性能。图3 水海绵凝胶的机械性能。(a)动态频率扫描流变曲线(25℃，Hz，0.1-100 rad/s)。(b)单轴压缩曲线。(c)90%应变下的压缩工作。(d)杨氏模量和应力。(e)85%大应变折线图下的单循环压缩曲线，(f)残余应变。作者通过压缩实验对水海绵凝胶的持水性能进行了表征。结果显示，在初始压缩过程中，水海绵凝胶首先表现出化学交联水凝胶的粘弹性，在小应变下不漏水。随着压缩应变的进一步增加，体积收缩，水从基质中扩散出来，而随着压缩力的释放，水可以迅速被快速吸收(~1s），表现出海绵状的多孔弹性变形。在压缩测试期间测量了取决于水海绵凝胶应变的重量变化，以找到水海绵凝胶的屈服点。结果显示，屈服点处的压缩应变随着纤维间交联密度的增加而增加。水海绵凝胶在屈服点表现出最大的应变(14%)，而纯壳聚糖微纤维水海绵凝胶的应变最小(7.2%)。此外，当水海绵凝胶与环氧氯丙烷(8.9%)、聚乙二醇二缩水甘油醚-200(9.2%)和聚乙二醇二缩水甘油醚-500(9.6%)交联时，屈服点应变逐渐增加。屈服点随着链长的增加而上升。这些现象表明，化学纤维间交联的形成可以增强水海绵凝胶的体积弹性，并防止水海绵凝胶在屈服点以下的体积变形过程中发生形貌变化。图4 水海绵凝胶的持水性能和屈服点。(a) 壳聚糖微纤维基水海绵凝胶的压缩和形态恢复图片。(b)壳聚糖微纤维基水海绵凝胶在压缩和恢复过程中内部结构变化的示意图。(c)水海绵凝胶压缩应变的代表性失重曲线范围为0%-90%。粘弹性和多孔弹性区域在屈服点处划分(水海绵凝胶为14%应变)。(d)水海绵凝胶压缩应变下的屈服点。每个数据条一式三份(n = 3)。作者通过通过连续压缩试验评价了环氧交联剂在80%应变下的抗疲劳性能的影响。在连续20次压缩循环后，随着环氧氯丙烷、聚乙二醇二缩水甘油醚-200、聚乙二醇二缩水甘油醚-500和交联水海绵凝胶，残余应变减小，自恢复率增加。环氧氯丙烷交联的水海绵凝胶的残余应变和自恢复率与纯壳聚糖微纤维水海绵凝胶几乎相同。由于纤维间交联效率高赋予水海绵凝胶高弹性，因此随着环氧交联剂纤维间交联效率的提高，水海绵凝胶的抗疲劳性能也有所提高。其中，水海绵凝胶表现出最小的残余应变(11.3%)和最大的自恢复率(95.3%)，显示出水海绵凝胶优异的抗疲劳性能。由于环氧含量高的可以有效地交联壳聚糖微纤维，赋予水海绵凝胶相对较好的抗疲劳性能。由于水海绵凝胶中存在丰富的动态氢键，氢键断裂引起的连续压缩试验后降低的杨氏模量和断裂应力有望在较长的静置时间后恢复。在承受80%应变后，静息时间延长至7 h，水海绵凝胶的压缩曲线几乎与初始曲线重叠。
图5 水海绵凝胶的抗疲劳性。(a)多个循环中水海绵凝胶压缩的宏观视图。(b)水海绵凝胶在连续循环压缩(80%应变)下的应力-应变曲线。(c)残余应变和自恢复率、(d)不同静息时间下水海绵凝胶的压缩曲线和(e)不同静息时间后杨氏模量的自恢复率。壳聚糖微纤维悬浮液粘度的变化赋予了水海绵凝胶的挤出形成性能。作者通过注射器将固体状壳聚糖微纤维悬浮液顺利地挤出，并形成独立的图案，不会改变其结构。作者显示了水海绵凝胶的结构，包括五角星网络、矩形网络、蜘蛛网结构、平面圆形网格、三角形网络和通过挤压成型方法制作的三维网络结构，并且具有三维结构的水海绵凝胶继承了本体水海绵凝胶的高弹性，压缩并没有破坏其三维结构。挤出成型性能有助于水海绵凝胶的定制。图6 水海绵凝胶的挤出成型行为。(a)在25 °C下以0.1至100 rad/s的剪切速率测量的水海绵的静态剪切粘度。(b)挤出成型过程的图像(比例尺：1厘米)。(c)采用挤压成型法制作的各种二维和三维图案，包括蜘蛛网结构、三维结构、矩形网络、平面圆形网格、五角星网络和三角形网络。(d)挤出成型成三维结构，水海绵凝胶在施加压力时可以释放一定量的水，当压力释放时，它可以吸收水，恢复原有的结构。作者用水海绵凝胶提取物培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并通过活/死染色试剂盒对CMFs基水海绵凝胶的体外生物相容性进行测试。将人脐静脉内皮细胞与水海绵凝胶提取物孵育24小时、48小时和72小时后，活细胞表现出强烈的绿色荧光(calsein-AM)，而具有红色荧光的死细胞(碘化丙啶)几乎不可见。CCK-8法测定水海绵凝胶的细胞毒性。在测试期间，观察到所有基于壳聚糖微纤维的水海绵凝胶具有无毒性，几乎达到90%以上的细胞活力。结果表明，基于壳聚糖微纤维的结果显示水海绵凝胶具有优异的体外生物相容性。图7 壳聚糖微纤维基水海绵凝胶的细胞相容性和血液相容性。(a)在纯壳聚糖微纤维、环氧氯丙烷、、聚乙二醇二缩水甘油醚-200、聚乙二醇二缩水甘油醚-500水海绵凝胶和对照组的24小时、48小时和72小时进行活细胞/死细胞染色(刻度：100μm)。在水海绵凝胶提取物中培养24小时(b)、48小时(c)和72小时(d)的HUVEC的细胞活力。(e)血液相容性和(f)溶血率的照片。作者通过在4周周期内皮下植入SD大鼠来评价水海绵凝胶的体内生物相容性。在1周和4周中，作为器官特异性疾病指标的酶和电解质的血液水平落在对照值的置信区间内植入组和对照组之间的白细胞、淋巴细胞、红细胞、血红蛋白、血小板和血细胞比容水平的平均计数没有显著差异。通过苏木精&伊红(H&E)和Masson三色染色分析水海绵凝胶的组织生物相容性，结果显示，植入物没有坏死或具有异物反应的迹象，也没有观察到过度的炎症反应。水海绵凝胶植入4 W后的面积小于1 W，表明其在体内可以随着时间的推移而生物降解。对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾等主要器官的H&E染色组织切片进行了分析，未发现明显的病理变化，未发现对大鼠有明显的全身副作用。作者为了评估体内新血管的形成，分析内皮细胞标志物（CD31）以反映血管化的程度。将水海绵凝胶植入大鼠体内1周和4周后，CD31染色为阳性，代表在皮肤下形成新的血管。为了进一步分析水海绵凝胶对SD大鼠炎症的影响，测试了TNF-α(炎性细胞因子)。TNF-α表达为阴性，表明水海绵凝胶植入物周围无明显的炎症反应。以上结果表明，水海绵凝胶具有优异的血液相容性、细胞相容性、无毒性、无炎症性、体内降解性和植入部位周围的血管生成活性。水海绵凝胶作为软组织重建的植入式支架具有很大的应用潜力。图8 水海绵凝胶的体内生物相容性和生物降解性。(a)SD大鼠皮下植入水海绵凝胶体内生物相容性和生物降解性的示意图。(b)植入28天后血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、尿素和肌酐(CREA)水平。(c)植入28天后白细胞(WBC)、淋巴细胞(Lymph)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)和血小板(PLT)平均计数的变化。将水海绵凝胶植入SD大鼠皮下注射，进行 1 W、4 W、H&E染色(d)和 Masson染色(e)(刻度：200μm)。数据显示为均值±标准差。(n = 5)。图9 水海绵凝胶对SD大鼠皮下血管生成和炎症反应的影响。(a)植入或不植入GTE海绵体的大鼠心、肝、脾、肺、肾的代表性H&E染色切片4W（规模：200 μm）。数据以均值±标准差表示。(n = 5). (b) CD31（红色）和TNF-α（绿色）免疫荧光染色在1W和4W（比例：100 μm）下的代表性照片。综上所述，作者开创性的提出了一种简便高效的合成策略制备了一种可定制的壳聚糖微纤维基水海绵凝胶，该水海绵凝胶表现出优异的弹性、抗疲劳性、低滞回性和快速的形状恢复(1 s)。挤出成型技术产生了各种结构的水海绵凝胶，表明壳聚糖微纤维悬浮液可以精确定制以制备所需的结构。水海绵凝胶具有良好的生物相容性。当皮下植入SD大鼠时，可在大鼠体内生物降解且不引起炎症反应，植入后可在周围组织中生成血管。该可定制壳聚糖微纤维基水海绵凝胶有望作为植入式支架用于生物医学应用领域。声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！
