手性化合物色谱分析方法开发(五)

上一节内容(详见文章下相关阅读)比较详细地介绍了添加剂的种类以及添加量，流速以及溶剂对于手性化合物分析方法开发的影响，即对于选择性因子，容量因子以及拖尾因子的作用。下面主要介绍色谱柱的柱温，正相体系中的痕量水，HPLC操作模式(等度洗脱模式或者梯度洗脱模式)对于手性化合物手性分析方法的影响。

如我们所知，温度在HPLC方法开发中占据举足轻重的地位，在范式方程中表达为传质阻力项，温度越高，对于流动相而言其粘度越小(如下表乙醇的粘度随温度的变化)，而仪器背压也就越低。更重要的是，升高温度减小了传质阻力，溶质在两相之间的分配速率亦会随之增加，色谱柱的理论塔板高度降低，色谱柱的柱效亦会增加。

Table 1 Viscosity of EtOH under different temperature

因此，增加色谱柱的温度，可以提高色谱柱的柱效，体现在色谱峰上，峰形更加尖锐，峰宽降低，并一般多伴随色谱峰的容量因子减小；降低色谱柱的温度，则色谱峰峰形变钝，峰宽增加，并一般多伴随容量因子增加。而对于选择性因子以及拖尾因子而言，需要具体情况具体分析，分别对待。此外，不同的手性液相色谱柱所允许的操作温度范围不同，在方法开发的时候，注意不要超过色谱柱所耐受的温度范围，以免损伤色谱柱，导致使用寿命减短。

温度对于手性化合物分离的选择性的影响，与化合物本身的性质有关，如热效应。如下图1A与图1B所示的两个例子。在图1A中，增大色谱柱的温度，选择性因子α从1.32减小为1.23，但在图1B所示的例子中，温度从25℃增加到40℃的时候，选择性因子α明显变大了很多。

Fig1A Selectivity factor changes with the column temperature

Fig1B Selectivity factor changes with the column temperature 

如下图2中所列公式所示，容量因子k的自然对数是焓、熵、绝对温度T、气体常数R以及相比Φ的函数。分别对对映异构体的容量因子的自然对数作图，得到下图中的线性模型，并将二者相减得到，下图3所示公式。

Fig2 Relationship between capacity factor of k and thermal effect

Fig3 Relationship between sensitivity factor of α and thermal effect 

上式表明，选择性因子α是熵差、焓差以及绝度温度的函数，而当α为1的时候，对映异构体之间的分离度为0，此时的温度为ΔΔH/ΔΔS，该温度为转变温度，对应于图2中两条线性拟合曲线的交点。当色谱柱的温度低于转变温度时，焓效应起主导作用，色谱柱的温度越低，选择性因子α也越大；而当色谱柱温度大于转变温度时，ΔS起主导作用，增大色谱柱的温度，选择性因子α也越大。

而在实际的应用中，多数化合物的转变温度并不在常用的手性色谱柱的允许温度范围内，要不过高，要不太低，因此，一般情况下，在常用手性HPLC色谱柱所耐受的温度范围内，温度对于α的作用，要不随温度的增加而增加，要不随温度的降低而增加(此时，又要将温度对传质阻力的影响结合起来一起考虑)，如下图4所示。

Fig4 Linear model of thermal effect on k 

如上图4所示，是反相体系下的一个线性模型的例子。两条曲线之间的纵向截距可表征lnα的大小，从图中可以看出，温度从5℃变化到60℃，lnα随温度的变化较小，且表现出，随着温度的减小，选择性因子α不断增大。除了上述的线性拟合模型之外，还常见一些非线性拟合模型，如下图5所示。

Fig5 Nonlinear model of thermal effect on k 

下图6是两个实例，左图的模型外推其转变温度高达550℃，右图转变温度低至-60℃。在这两个例子中，实验室以及仪器可允许条件下，温度对于选择性因子α的影响均是单边方向性的，要不正相关，要不负相关。但也不排除，转变温度处于常温的情况，此时改变色谱柱的操作温度，可能会导致色谱峰出峰顺序的反转，这时对于某些拖尾峰以及杂质干扰的情况有特殊意义。

Fig6 Examples of extreme transformation temperature under linear model 

如下图7所示同一手性化合物在不同的两根色谱柱上的转变温度不同，但均处在可耐受温度范围之内。转变温度的高低不仅与化合物本身的性质，色谱柱固定相的性质有关，还与流动相的组成，添加剂的种类及浓度均有关系。

Fig7 Examples of controllable transformation temperature 

通过改变温度，如升高温度的方法来提高手性异构体分离效果(增大选择性因子)的时候，还需要注意，有些手性化合物在高温条件下可能会出现消旋化的现象，如下图8所示。

Fig8 Phenomenon of racemization in chiral separation 

手性化合物在色谱柱内消旋产生的色谱峰间平台，可通过降低柱温的方式消除，这时需要与阻转异构体所产生的色谱柱内转化平台进行区分，手性化合物消旋平台可通过降温来消除，而对于扭转异构体来说，转化平台不太可能通过降低色谱柱温度的方式消除。

在正相HPLC操作模式中，我们常使用正己烷、正庚烷作为非极性洗脱剂，乙醇、异丙醇等醇类作为极性洗脱剂，而有机醇类流动相在开瓶之后，会吸收空气中的水分，使得有机溶剂中混入一些痕量的水，而这些痕量的水，有时候会对手性分析方法的开发带来干扰(有时负面影响，有时正面影响)，甚至影响分析方法开发的进程以及分析方法的转移，特别是对于涂覆型的多糖衍生物的手性色谱柱，如下图9例子所示。

Fig9 Effect of trace water on the selectivity factor in chiral separation 

如上图9中所示，有机溶剂中没有水分的时候，手性化合物完全分不开，分离度为0，随着痕量水增加到500 ppm的时候，对映异构体的色谱峰已经达到了基线分离。在正相手性色谱中，痕量水的存在可改变固定相的状态，特别是多糖衍生物手性色谱柱，如纤维素以及淀粉的溶胀程度；改变溶质与固定相之间的相互作用力，如由氢键相互作用向着疏水相互作用转变。因此，在正相手性色谱方法开发的时候，注意查看所用到的有机相的开瓶日期，特别是醇类有机相。

再如下图10所示，选择性因子α，随着痕量水的增加呈现出先减小而后增加的现象。

Fig10 Example of trace water on the selectivity factor in chiral separation 

痕量水的这种作用对化合物的种类具有选择性，主要对于手性中心α或β位含有极性官能团结构的极性化合物作用较大；对固定相的种类具有选择性，主要是涂覆型多糖衍生物手性柱，如OD-H，AD-H等；随水分的增加，对于对映异构体的分离的主要驱动力发生转变。另外，痕量水的增加，有时也会使得转变温度发生改变(洗脱顺序发生转变)，其方向与大小和流动相的种类，色谱柱的类型，化合物本身的特点都有关，如下图11所示。

Fig11 Effect of trace water on transformation temperature 

以上介绍了这么多关于痕量水的影响，意在提示，在方法开发的时候，注意所用溶剂的状态，特别是醇类，长期开口之后，易引入痕量水，一旦待分离的化合物对水比较敏感，可能导致方法开发不成功或者在方法转移的时候，出现不耐用的情况，并不鼓励主动地往有机溶剂中人为添加一定量的水。

一般地，我们在反相HPLC中经常使用到梯度洗脱模式，在该模式下能够使得各洗脱组分在拥有足够的分离度的前提下，都能够有一个合适的容量因子，且色谱峰峰宽得到较好控制，也提高了方法的灵敏度。在正相HPLC中，一般使用等度洗脱模式较多，该种模式能够提供足够大的分离度，但有时伴随着分离时间较长的缺点，特别是对于多对对映异构体而言，较难做到灵敏度与分离度兼得。

而影响梯度模式在正相HPLC中应用的主要因素在于压力以及难重现性，因此，控制好压力以及有机相中的水的含量，正相HPLC梯度模式完全是可行的，至少在方法初试的阶段是可以的，如下图12所示，是Lilly使用梯度方法筛选18个月之后的柱效对比图，色谱柱未见有柱效明显下降现象。

Fig12 Comparison of column efficiency under gradient pattern

色谱柱的温度影响传质阻力的大小，增加柱温，流动相的粘度降低，传质阻力减小，理论塔板数增加，相应的色谱柱的柱效得到提升，会使得色谱峰的峰形变得尖锐；此外，温度亦会通过热效应对对映异构体分离的选择性因子产生重要影响，而温度的变化对分离度的作用需要具体情况，分别处理。有机相中的痕量水，虽然有时候会增大选择性因子α，但并鼓励人为添加一定量的水到有机溶剂中，此外梯度模式，在控制好压力以及有机相中的水分的时候，也是可以用于正相HPLC中的，无论是涂覆型多糖衍生物色谱柱还是键合型的多糖衍生物色谱柱。

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