HPLC最全解析：绝对实用。。。

高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。。。

HPLC与经典LC区别

主要区别：

固定相差别，输液设备和检测手段。

1.LC： 仅作为一种分离手段；

①柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀；

②常压输送流动相；

③柱效低（H↑，n↓）；

④分析周期长；

⑤无法在线检测；

2.HPLC： 分离和分析；

①柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）；

②高压输送流动相；

③柱效高（H↓，n↑）；

④分析时间大大缩短；

⑤可以在线检测；

HPLC与GC差别

相同：

兼具分离和分析功能，均可以在线检测；

主要差别：

分析对象的差别和流动相的差别；

1.分析对象

GC：

①能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；

②高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，占有机物的20%；

HPLC：

①溶解后能制成溶液的样品；

②不受样品挥发性和热稳定性的限制；

③分子量大、难气化、热稳定性差及高分子；

④和离子型样品均可检测；

⑤用途广泛，占有机物的80%；

2.流动相差别

GC：

①流动相为惰性气体；

②组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用；

HPLC：

①流动相为液体；

②流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用；

③流动相种类较多，选择余地广；

④流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用；

⑤选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相；

⑥可以增大分离选择性；

3.操作条件差别

GC：

加温操作 ；

HPLC：

①室温；

②高压； （粘度大，峰展宽小）

HPLC法中分离条件的选择

1.固定相与装柱方法的选择：

选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）；

首选化学键合相，匀浆法装柱；

2.流动相及其流速的选择：

选粘度小、低流速的流动相—甲醇，1mL/min；

3.柱温的选择：

选室温25℃左右；

各类高效液相色谱法

( 一 ) 液固吸附色谱法（ LSC ）

流动相为液体，固定相为固体吸附剂 ；
1 ．分离机制：

利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力差异；
分离前提：

K 不等或 k 不等；
2 ．固定相：

与 LC 比，固定相粒径不同（ <10μm ）；
3 ．流动相：

底剂（烷烃） + 有机极性调节剂；
※例：正己烷或庚烷 + 氯仿。。。
4 ．影响 K 的因素：

与固定相性质和流动相性质有关；
溶质分子极性 ↑ ，洗脱能力 ↓ ， k↑ ， t _R ↑ ；
溶剂系统极性 ↑ ，洗脱能力 ↑ ， k↓ ， t _R ↓ ；
注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间；
5 ．出柱顺序：

强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱；
6 ．硅胶吸水量 ↑ ， LSC→LLC
硅胶含水量较小，吸附色谱，硅胶极性较大；
硅胶含水量 >17% ，分配色谱，硅胶失活 → 载体；
吸附的水 → 固定液
( 二 ) 液 - 液分配色谱法（ LLC ）
1 ．分离机制：

利用组分在两相中溶解度的差异
2 ．固定相：

载体 + 固定液 （物理或机械涂渍法）
缺点：

系统内部压力大，易流失，不实用
固定液 - 极性 →NLLC

固定液 - 非极性 →RLLC
3. ①正相色谱 - 固定液极性 > 流动相极性（ NLLC ）
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱：适于分离极性组分；
②反相色谱 - 固定液极性 < 流动相极性（ RLLC ）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱：适于分离非极性组分；
( 三 ) 化学键合相色谱法（ BPC ）
1.化学键合相
（1） 分离机制：

分配 + 吸附（以 LLC 为基础）；
（2） 特点：
1 ）不易流失；
2 ）热稳定性好；
3 ）化学性能好；
4 ）载样量大；
5 ）适于梯度洗脱；
2.反相键合相色谱
（1） 分离机制：

疏溶剂理论；
正相 - 流动相与溶质排斥力强，作用时间 ↑ ， K↑ ，组分 t _R ↑ ；
反相 - 流动相与溶质排斥力弱，作用时间 ↓ ， K↓ ，组分 t _R ↓ ；
（2） 固定相：

极性小的烷基键合相；
C ₈ 柱， C ₁₈ 柱（ ODS 柱 -HPLC 约 80% 问题）；
（3） 流动相：

极性大的甲醇 - 水或乙腈 - 水；
流动相极性 > 固定相极性；
底剂 + 有机调节剂（极性调节剂）；
例：水 + 甲醇，乙腈， THF ；
（4） 流动相极性与 k 的关系：

流动相极性 ↑ ，洗脱能力 ↓ ， k↑ ，组分 t _R ↑
（5） 出柱顺序：

极性大的组分先出柱；

极性小的组分后出柱；
（6） 适用：

非极性 ~ 中等极性组分（ HPLC 80% 问题）

3. 正相键合相色谱
(1)分离机制：

溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力
(2)固定相：

极性大的氰基或氨基键合相；
(3)流动相：

极性小（同 LSC ）；底剂 + 有机极性调节剂；
例： 正己烷 + 氯仿 - 甲醇，氯仿 - 乙醇；
(4)流动相极性与 K 的关系：
流动相极性 ↑ ，洗脱能力 ↑ ，组分 t _R ↓ ， k↓ ；
(5)出柱顺序：

结构相近组分，极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱；
(6)适用：
氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小），分离物质也相似；
氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性，分析极性大物质、糖类等；
4.离子对色谱和离子抑制色谱
反相离子对色谱法（ IPC 或 PIC ）
反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加 K 和 t _R ，以改善分离；
(1) 离子对试剂：

烷基磺酸钠 → 分析碱
四丁基季胺盐 → 分析酸