童鞋，有没有做过基因敲除实验呢？Crispr/Cas9接触过吗？为了发好文章是不是也开始跃跃欲试了呢？
Crispr/Cas9基因编辑技术带给科研世界的不仅仅是一种高效快速精准的技术，更是一场革命。技术的更新换代太快了，商业化的运作使得技术发展如虎添翼，20世纪需要10~20年才能被有效地利用起来，现在只需要1~2年就可以无孔不入了，在上海，光能搜索得到的Crispr/Cas9编辑公司就不下40家，更何况是哪些看不见的呢，既然林子大了什么鸟都有，那么遇到烂公司就不算是小概率事件了。
那既然技术这么成熟，咱们该自己做呢？还是交给外面的公司做呢？很多有科研情怀、本着技多不压身理念的童鞋会选择自己亲自操刀，尝试Crispr/Cas9基因编辑技术，那开始的时候，咱先从Crispr/Cas9的原理讲起吧。
(一) Crispr/Cas9起源于细菌对抗病毒的斗争
免疫系统（Immune system）是个非常强大的防御保护模式，它是抵抗外来侵害的主要手段。人有免疫系统，当结核杆菌侵染到人体血液时，免疫系统就开始工作了，婴儿时期已经被卡介苗免疫过，机体中针对结核杆菌的淋巴B细胞会在一系列的结核杆菌的刺激下，大量增殖，并大量地产生中和抗体，使得结核杆菌被巨噬细胞识别、吞噬，从集体中清理出来。
这种防御模式被科学家应用起来，大家也都非常熟悉的技术，例如大家平常使用的抗体，ELISA试剂盒，免疫组化IHC，ChIP等免疫技术，都是基于这套机体的免疫系统原理：抗体识别抗原。
机体对待入侵者的过程是识别、产生记忆、再次入侵、消除。Crispr/Cas9在微生物中起到的作用就是识别入侵、将病毒的DNA录入自己的基因组，当病毒再次入侵时候，切割病毒DNA、RNA进而消除病毒的感染。
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个细菌免疫系统，细菌地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。
CRISPR/Cas9 系统介导的基因组编辑是由sgRNA引导的，对靶序列的识别是 RNA 与 DNA 的碱基配对过程，然后Cas9核酸酶将DNA给咔嚓一刀切开了，相比蛋白质对 DNA 序列的识别要精确更多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。CRISPR/Cas9 的构建仅仅需要设计与靶序列互补的 RNA 即可，普通的实验室也可以自行完成构建，这大大提高了基因操作的效率及简便性。
（二）Crispr/Cas9分子机制原理
我们从上面的讲述中知道，Crispr技术有两个分子在参与：Cas9核酸酶+sgRNA（自行设计）。
其中Cas9核酸酶的基因已经被整合到商业化载体中，只要自行设计sgRNA，然后构建Cas9/sgRNA表达载体，转染细胞，就可以行使基因组的定点基因编辑任务。
sgRNA（small-guided RNA）是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，由两部分组成—tracRNA和crRNA，两部分融合表达后，即sgRNA，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。
（三）SgRNA的序列特征和设计
SgRNA 设计靶序列选择：在NCBI找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子。可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果被敲除的靶标基因是microRNA或者lncRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
SgRNA的序列特征
运行中的sgRNA序列设计工具
确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA 的软件中（例如http://crispr.mit.edu/ ），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。根据设计的 sgRNA 靶点序列，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG合成一对序列互补的DNA Oligos。
SgRNA脱靶问题一直备受关注，如何设计特异性好的靶点成为大家关注的焦点，大体原则如下：
（1）对于sgRNA的长度，一般应为20 nt左右；
（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%~60%；
（3）sgRNA在设计网站上的评分越高，越容易脱靶；
（4）如需造成基因knockout，需尽量选择包含有ATG的外显子或靠近ATG的外显子；
（5）检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；
（6）如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑sgRNA之间的间距；
（7）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数。
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