【业务介绍】蛋白小量表达和纯化

伯远生物 · 公众号 · · 2024-04-10 08:51

正文

背景介绍

大肠杆菌原核表达系统是迄今为止最为成熟可靠的蛋白表达系统之一，能快速表达不同种属来源的外源基因。通过对需要表达的外源基因的DNA序列进行密码子优化以及对表达载体、表达菌株、培养条件和诱导时间等各种因素的综合测试，实现外源基因在大肠杆菌内的表达。表达的重组蛋白经纯化后可用于相应的生物学研究。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的蛋白表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。

原理简介

Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的蛋白，每个亚基都含有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，从而抑制转录启动。而当有诱导剂（这里指IPTG）存在时，诱导剂可与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，启动子P开始发生转录。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。然而在实验中，通常选用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，IPTG是一种非常稳定且不被细菌代谢的强效诱导剂，因此在实验室中得到广泛应用。

实验流程

构建蛋白表达载体——转化大肠杆菌——蛋白小量表达测试——蛋白大量表达——纯化——SDS-PAGE检测

文献案例

2021年11月，浙江农林大学樊怀福课题组在 International Journal of Biological Macromolecules 杂志上发表了一篇题为“Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber”的研究论文。在前期研究中，作者在黄瓜中发现了一个具有凝集素特性的蛋白CsPP2-A1，为了进一步探究CsPP2-A1的生物活性，作者对CsPP2-A1进行了原核表达和纯化。作者先设置两个温度（15°C和37°C）对CsPP2-A1进行小量表达测试，结果发现较低温度（15°C）下CsPP2-A1可以高效表达，而较高温度（37°C）下CsPP2-A1会形成包涵体。后续在较低温度（15°C）下进行大量表达CsPP2-A1，再通过不同浓度的咪唑进行洗脱时，发现CsPP2-A1可以被500mM的咪唑有效洗脱下来。

图 CsPP2-A1的表达和纯化(Du et al., 2022)。（A）CsPP2-A1连接到pET-30a后酶切验证。（B）不同温度（15°C和37°C）下诱导后的SDS-PAGE。泳道1，pET-30a空载体（阴性对照）；泳道2，15°C诱导过夜；泳道3，37°C诱导过夜。（C）低温诱导（15°C）后的SDS-PAGE。泳道1，离心后上清液；泳道2，Ni-IDA孵育后的流出液；泳道3，IMAC纯化，50mM咪唑洗脱级分；泳道4-5，IMAC纯化，100mM咪唑洗脱级分；泳道6-13，IMAC纯化，500mM咪唑洗脱组分。

常见问题

克隆载体和表达载体有什么区别？

克隆载体：都有一个松弛的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增，用于克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。

表达载体：在克隆载体基本骨架上添加了表达系统元件（启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号），使目的基因能够在宿主细胞中进行功能性表达。

采用融合标签表达的目的是什么？

融合标签用于检测和纯化目的蛋白。有时也可以增加目的蛋白在细胞质中的可溶性，或帮助将目的蛋白转运到细胞周质中，从而提高目的蛋白的生物活性。常用的可溶性标签包括GST、MBP、SUMO等，通过将这些标签与外源蛋白质融合后，可以促进外源蛋白的可溶性表达。

蛋白纯化标签应该如何选择？

在进行蛋白表达时，选择合适的标签有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，因此了解几种常用的蛋白纯化标签很重要。一般来说，常用的蛋白纯化标签主要有His tag、GST tag、MBP tag等。

（1）His tag（组氨酸标签）融合蛋白是目前最常见的表达方式，其优点是标签小，纯化步骤简便，纯化条件温和，能纯化可溶性/包涵体蛋白，一般不会影响蛋白的功能结构，且可以产出大量的目标蛋白，但该标签不适合易氧化蛋白或膜蛋白的纯化。

（2）GST tag（谷胱甘肽巯基转移酶标签）的洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合Pull-down检测，具有很好的线性动态范围，但分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，如果蛋白不可溶，很难用变性的方法进行纯化。此外，GST tag后期可以用蛋白酶处理从而去除。

（3）MBP tag（麦芽糖结合蛋白标签）可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大，对蛋白的结构和功能会有一定影响。此外，MBP tag后期也可以用蛋白酶处理从而去除。

为什么要进行密码子优化？

密码子优化是基因表达优化的关键步骤之一，基因序列GC含量比例不当、序列中的终止密码子、转录后mRNA的二级结构、核糖体结合位点以及密码子偏爱性等，这些都会影响到蛋白表达。

有些蛋白为什么在大肠杆菌中表达出来与原本物种表达的不一样？

重组蛋白在大肠杆菌中表达很难准确折叠的主要原因是大肠杆菌的细胞质环境呈现还原性，不利于二硫键的形成。针对这一原因，研究人员对细胞内表达，主要还原途径的两个关键酶的基因进行突变。构建了有利于二硫键形成，蛋白准确折叠的感受态细胞。

为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？如何避免包涵体的形成？

在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白的表达水平通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度或IPTG浓度并延长诱导时间，或者采用特殊的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。

跨膜蛋白为什么很难表达？

（1）跨膜蛋白一般都是由强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式连接而成，形成亲水疏水交替排列的一个最简单的跨膜化学结构。这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程。有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。

（2）另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。

如果去除信号肽，会不会影响蛋白本身的表达？

重组蛋白表达强度不受信号肽调控，所以去除信号肽不会影响蛋白质表达。但是信号肽一方面参与蛋白质折叠成特定空间结构，另一方面还决定蛋白最终被定位到特定的亚细胞区，一般蛋白只有在特定亚细胞区才能发挥其功能，所以信号肽对蛋白最终活性还是有很大影响的。

表达得到的蛋白是有活性的么？

需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯化后得到的蛋白活性要好，尽量从上清中获得蛋白。

如何确认表达的蛋白就是我的目的蛋白？

（1）首先在分子序列层面，表达载体构建完成后，会对质粒进行测序确认，有测序文件可以查证。

（2）其次在表达过程中，会设置诱导和未诱导的两种裂解液对比，通过SDS-PAGE检测蛋白条带的差异，在目的蛋白的理论大小位置处，可以看到差异。

（3）最后，可以通过标签抗体或目的蛋白抗体进行WB验证。

目的蛋白大小不正确？

蛋白的结构对判断分子量大小有一定影响。可以通过加热变性蛋白，从而准确判断蛋白大小，确认蛋白表达是否完整，蛋白是否提前终止表达。若形成二聚体甚至多聚体，可以通过加热变性蛋白打开二硫键（加入DTT、β-ME等还原剂）等手段，破坏次级结构，准确判断蛋白分子量大小。

导致蛋白表达量低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？

当使用原核系统表达真核蛋白时，像所有生物一样，大肠杆菌对密码子的使用有偏性，其tRNA丰度反映了这一偏性。表达含有数个大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白时会受对应的tRNA丰度的限制而效率不高。tRNA短缺会导致翻译移框、氨基酸错误掺入及翻译提前终止等。这个问题在稀有密码子集中分布于N端时尤其明显。不过，通过合成密码子优化的基因或者使用稀有密码子tRNA丰度增加的商业化工程菌株可以避免这个问题。

蛋白质纯化后如何储存？

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