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具有免疫调节的粘蛋白水凝胶预防髓核摘除术后的退变

BCML速递 · 公众号 · · 2024-09-11 20:00

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椎间盘是人体最大的无血管组织，主要由中央的髓核、周围的纤维环及上下软骨终板组成。这种独特的结构导致髓核自形成起就与机体的免疫系统相隔离，因此椎间盘被认为是一个免疫赦免器官。免疫赦免状态的稳定是椎间盘维持自身稳态的基础。当发生椎间盘突出时，通常需要手术干预，比如髓核摘除术，来缓解疼痛和神经压迫。然而，髓核摘除术无法有效修补纤维环，致使残留的髓核暴露于免疫系统，进而引起强烈的自身免疫反应，促使免疫细胞浸润和攻击，加剧椎间盘变性，最终导致髓核再突出。研究表明，巨噬细胞是这一过程中的关键免疫细胞，因为它们在退变椎间盘样本中的浸润已被广泛证实，并且巨噬细胞的数量与椎间盘退变的程度呈正相关。尽管组织工程领域在椎间盘的再生和修复方面做出了巨大努力，但由于椎间盘的无血管性、低细胞密度以及脊柱复杂的力学环境，这些干预措施的有效性常常受到限制。最近，苏州大学的李斌教授和陈嵩教授的研究团队与乌普萨拉大学的闫宏吉教授团队携手，基于生物体表面天然黏液蛋白的特性，共同研发了一种粘蛋白水凝胶（ Muc-gel ）。粘蛋白是一种广泛存在于动物界中的糖蛋白，它在免疫调节中发挥着重要作用，不仅能够诱导树突状细胞的免疫耐受，还能有效调节巨噬细胞的激活和极化过程，展现出对多种免疫细胞的广泛影响。该水凝胶可在短时间内实现凝胶化，使其注射到受损纤维环部位后能快速原位固化，为局部提供即时的物理和免疫保护，防止髓核突出，进而延缓椎间盘进一步退变（图 1 ）。

研究人员通过收集人椎间盘样本，探究巨噬细胞在椎间盘退变过程中的浸润程度。根据 Pfirrmann 分级将组织样本分为正常 / 轻度退变组和重度退变组。通过免疫组织化学染色，检测各组样品中巨噬细胞（ CD68 ⁺ ）、 M1 型巨噬细胞（ CD80 ⁺ ）、 M2a 型巨噬细胞（ CD206 ⁺ ）以及 M2c 型巨噬细胞（ CD163 ⁺ ）的浸润数量。结果如图 2 所示，在重度退变的椎间盘样本中检测出大量的 CD68 ⁺ 和 CD80 ⁺ 的巨噬细胞，在正常 / 轻度退变椎间盘样本中未观察到明显的巨噬细胞浸润。同时，与正常 / 轻度退变组相比，严重退变组中白介素 -1β （ IL-1β ）和 C-X-C 基序趋化因子配体 8 （ CXCL8 ）水平升高（图 3 ）。这些结果表明 M1 型巨噬细胞可通过促进炎症环境和随后的组织损伤而导致椎间盘退变的发生发展。

在观察到巨噬细胞在严重退变的椎间盘中的存在，尤其是 M1 表型后，研究人员接下来在小鼠皮下移植模型中探究 Muc-gel 是否能够阻止 M1 型巨噬细胞向椎间盘浸润。如图 4 所示，在海藻酸钠水凝胶（ Alg-gel ）和 Muc-gel 包封自体椎间盘植入皮下 2 w 后，在未包封组和 Alg-gel 包封组中可以看到自体椎间盘被纤维结缔组织包裹，并且大量纤维结缔组织侵入椎间盘组织中，与椎间盘组织边界模糊。在 Muc-gel 包封组中的椎间盘具有正常的组织形态，并且与周边的纤维结缔组织分界清晰。这表明 Muc-gel 能够阻碍组织向椎间盘内生长，具有显著的屏障作用。

接着，研究人员通过流式细胞术对移植物中的巨噬细胞浸润数量和表型进行了定量分析。在未包封组和 Alg-gel 包封组的移植物中存在大量巨噬细胞（ F4/80 ⁺ CD11b ⁺ ），而且主要以 M1 型巨噬细胞为主（ F4/80 ⁺ CD11b ⁺ CD86 ⁺ ）。在 Muc-gel 显著抑制了巨噬细胞浸润（ F4/80 ⁺ CD11b ⁺ ），包括 M1 型巨噬细胞（ F4/80 ⁺ CD11b ⁺ CD86 ⁺ ）和 M2 型巨噬细胞（ F4/80 ⁺ CD11b ⁺ CD163 ⁺ ）（图 5 ）。这些发现进一步证实了 Muc-gel 不仅能够形成物理屏障，还充当营造免疫抑制的微环境，这有助于减少免疫细胞的招募和激活，保护椎间盘免疫反应赦免状态，从而为维持椎间盘稳态提供了更为有利的条件。

最后，研究人员通过针刺技术损伤大鼠尾椎椎间盘的纤维环组织，构建模拟髓核突出的动物模型。在术后 4 和 8 w ，使用 Muc-gel 治疗的椎间盘在 MRI 图像上显示出与假手术组相似的亮度，这表明 Muc-gel 在维持椎间盘水分方面具有积极作用。相比之下，接受 Alg-gel 或 PBS 处理的椎间盘在 MRI 图像上的亮度明显下降（图 6A 和 B ）。并且 Muc-gel 治疗组的椎间高度指数（ DHI ）保持在 85% ，与假手术组相近，而 Alg-gel 和 PBS 组的 DHI 则显著降低（图 6C 和 D ）。 Micro-CT 图像显示，与 PBS 组和 Alg-gel 组相比， Muc-gel 治疗组的椎骨结构更为完整（图 6E ）。椎间盘大体形态进一步显示出，在 Muc-gel 组中的椎间盘具有更大更饱满的髓核组织，并且纤维环与髓核组织间有明显的分界线。然而，在接受 Alg-gel 和 PBS 治疗的椎间盘则出现了髓核组织的萎缩或消失（图 6F ）。这些结果表明， Muc-gel 在治疗椎间盘退变方面具有巨大潜力。它可能维持椎间盘缓冲功能，进而预防椎骨增生、终板骨折或 Modic 变化等病理变化的发生。

随后，通过 HE 染色和 S.O. 染色对椎间盘的组织学特性进行了深入评估。染色结果发现，术后 4 w ，在 PBS 组中可以观察到髓核区域减少，并有部分髓核组织向外突出。在术后 8 w 时， PBS 组中的髓核组织已消失不见了。虽然在 Alg-gel 组中未见观察到突出的髓核组织，但是随着治疗时间的延长，髓核组织逐渐退变并减少。经 Muc-gel 处理后，不仅限制了髓核突出，还有效维持了椎间盘组织形态（图 7A 和 B ）。角蛋白 19 （ Krt19 ）是一种中间丝家族的蛋白分子，是识别和表征椎间盘髓核细胞的关键标记物。术后 4 w ，在 PBS 处理组中，可在椎间盘周边检测到 Krt19 阳性细胞群，进一步支持了组织学的观察结果。而这一现象在 Alg-gel 和 Muc-gel 处理组中并未观察到。更为重要的是， Muc-gel 处理的 IVDs 在 Krt19 的表达模式和空间分布上与假手术组保持一致。与此相反， Alg-gel 和 PBS 处理组的 Krt19 表达从 4w 到 8w 呈现显著下降趋势（图 7C-E ）。这些重要发现表明 Muc-gel 能够维持椎间盘形态和髓核细胞的表型，强调了 Muc-gel 封堵破裂纤维环对于防止髓核进一步流失和延缓组织退变的重要性。

为了深入探究 Muc-gel 的治疗效果，研究人员继续使用流式细胞术定量分析术后椎间盘中巨噬细胞的比例和表型。研究结果表明，与 Alg-gel 和 PBS 处理组相比，在第 1 、 4 和 8w ， Muc-gel 显著抑制巨噬细胞浸润（ CD68 ⁺ CD11b ⁺ ），特别是 M1 型巨噬细胞（ CD68 ⁺ CD11b ⁺ CD80 ⁺ ）。这些研究结果凸显了 Muc-gel 的双重作用，不仅作为物理屏障封闭损伤区域，更能够抑制巨噬细胞浸润和激活，维持椎间盘的免疫赦免生位态，有助于预防椎间盘进一步退变。

本研究由苏州大学的李斌教授、陈嵩教授研究团队与乌普萨拉大学闫宏吉教授团队合作完成，并于 2024 年 8 月 29 日在线发表于 Advanced Science 。

论文信息： Huan Wang ^# , Song Chen ^#, *, Zhao Liu, Qingchen Meng, Rita Sobreiro-Almeida, Ling Liu, Håvard Jostein Haugen, Jiaying Li, João F Mano, Youzhi Hong, Thomas Crouzier, Hongji Yan*, Bin Li*. Preserving the Immune-Privileged Niche of the Nucleus Pulposus: Safeguarding Intervertebral Discs from Degeneration after Discectomy with Synthetic Mucin Hydrogel Injection. Advanced Science 2024, doi: 10.1002/advs.202404496.

供稿：王欢

审校：袁章琴

编辑：朱壮