大家好！今天来来了解一篇《Molecular basis for the diversification of lincosamide biosynthesis by pyridoxal phosphate-dependent enzymes》发表于《Nature Chemistry》的研究论文。这篇论文揭示了磷酸吡哆醛（PLP）依赖性酶 LmbF 和 CcbF 在林可酰胺生物合成中多样化的分子基础，为我们理解和调控这一生物合成过程提供了重要依据。
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一、研究背景
（一）林可酰胺抗生素概述
林可酰胺类抗生素，包括林可霉素 A（1）、天青菌素（2）和 Bu - 2545（3）等，是由链霉菌属产生的抗菌天然产物。其中，林可霉素及其半合成衍生物克林霉素在临床上用于治疗革兰氏阳性菌感染。这些化合物通过与 50S 核糖体亚基的肽基转移酶结构域结合，抑制蛋白质合成的早期阶段。林可酰胺的结构特点是具有一个硫辛糖核心，该核心与 N - 甲基 - (4R) - 丙基 - L - 脯氨酸（N - 甲基 - PPL，如在 1 中）或 N - 甲基 - L - 脯氨酸（N - 甲基 - Pro，如在 2 和 3 中）相连，并且具有差异化衍生的 S - 烷基部分。
（二）S - 烷基部分的重要性及合成相关酶
先前的结构 - 活性关系研究表明，硫辛糖核心的 S - 功能化对其抗菌活性强度至关重要。例如，将水杨酸酯通过二碳醇连接到硫辛糖核心上，相较于 S - 甲基或 S - 乙醇基团，可提高抗菌活性。在林可霉素 A（1）和天青菌素（2）的生物合成中，S - 烷基部分的结构多样性是由 PLP 依赖性酶 LmbF 和 CcbF 催化产生的。尽管这两种酶具有一定的氨基酸序列相似性，但它们对相同底物结构（如 S - 糖基 - L - 半胱氨酸 4 和 5）催化不同的修饰反应。
（三）LmbF 和 CcbF 催化反应差异及问题提出
LmbF 催化底物 4 的 L - 半胱氨酸部分发生 β - 消除反应，伴随 C - S 键断裂生成硫醇 6，随后硫醇 6 被甲基转移酶 LmbG 甲基化生成林可霉素 A（1）。而 CcbF 催化半胱氨酸部分的氧化脱氨与脱羧反应，生成 S - 乙醛 7，7 经下游修饰酶还原为 S - 乙醇并转化为天青菌素（2）。虽然 LmbF 和 CcbF 的催化功能已在体内和体外得到研究，但它们反应选择性差异的结构基础，包括详细的催化机制，仍有待阐明。这就是本研究要解决的关键问题。
二、研究结果
（一）LmbF 和 CcbF 的结构分析
1、晶体结构解析
为了理解 LmbF 和 CcbF 之间差异的分子基础，研究者解析了它们与 PLP 结合的 X - 射线晶体结构。LmbF 和 CcbF 的整体结构具有 I 型折叠，高度同源（386 个氨基酸的 Cα 原子的均方根偏差为 1.6 Å）。
在活性位点，PLP 分别与 LmbF 的催化 Lys270 和 CcbF 的 Lys260 残基共价结合形成内醛亚胺。在 LmbF 活性位点，PLP 的 N1 和 C3 - 羟基分别与 Asp233 和 Asn205 相互作用，磷酸基团与 Thr122、Ser267 和 Ser269 形成氢键，Trp150 通过 π - π 相互作用与 PLP 的吡啶环相互作用；CcbF 活性位点也有类似的氢键网络和 π - π 相互作用。
然而，活性位点腔周围的残基存在差异，如 LmbF 中的 Asn205、Phe236、Leu83′和 Pro302′在 CcbF 中分别被 Tyr195、Tyr226、Tyr72′和 Tyr292′取代，这些差异被认为对酶反应的选择性很重要。
2、分子动力学模拟
Cα - X 键（待断裂键）通常垂直于 PLP 的吡啶环，因为这样 Cα 上产生的负电荷可通过共振与 PLP 的共轭 π 系统稳定。通过对接和分子动力学模拟发现，底物 4 的外部醛亚胺中间体与 LmbF 活性位点结合时，半胱氨酸部分的羧酸盐基团、PLP 的 C3 - 羟基和 Asn205 之间形成氢键，Cα - H 键与 PLP 吡啶环的二面角 ϕ 稳定维持在 - 70° 至 - 90°，表明 Cα - H 键与共轭 π 系统的 P 轨道平行，且 Lys270 的 ε - 氨基在 Ca - H 原子的一定范围内，其与底物 4 的 S 原子距离小于 3.5 Å，可能作为酸碱催化剂促进 C - S 键断裂。
在 CcbF 中，His76 与底物的酰胺相互作用，Trp140 和 Asp141 与半胱氨酸部分的羧酸盐形成氢键网络，使 Cα - COO⁻键与 PLP 吡啶环的二面角 ψ 维持在约 90°，底物 4 的 PLP 部分灵活且位于活性位点入口。
当 CcbF 以与 LmbF 相似构象的外部醛亚胺中间体进行分子动力学模拟时，发现羧酸盐结合不稳定，其与活性位点残基的相互作用改变，二面角 ϕ 在 0° 至 - 90° 之间变化，且 Lys260 的 ε - 氨基因空间位阻无法接近 Cα - H 原子和底物 4 的 S 原子，表明这种类似 LmbF 的构象在 CcbF 中是非反应性结合模式。
此外，在 CcbF 反应中，脱羧后的醌中间体与分子氧反应生成半醌和超氧阴离子，其活性位点的四个酪氨酸残基（Tyr195、Tyr226、Tyr72′和 Tyr292′）与底物 Cα - N 键距离大于 4.5 Å，不与 Trp140 或其他氨基酸相互作用，因此底物的 Cα 不会像其他酶那样被活性位点残基质子化。
（二）CcbF 的定点突变研究
为研究 CcbF 活性位点残基对反应选择性的重要性，对关键残基（Tyr72′、Trp140、Tyr195、Tyr226、Lys260 和 Tyr292′）进行定点突变，用 LmbF 中的相应残基（Leu83′、Asn205、Phe236 和 Pro302′）或丙氨酸替代。结果发现，Y72L、Y226F 和 Y292P 突变体保留了产生 8 的活性（14 小时内分别为野生型的 47%、54% 和 29%），而 W140A、Y195N 和 K260A 几乎失去此活性。
有趣的是，CcbF Y195N 突变体虽然氧化脱氨活性大幅降低，但生成了新产物 9（m/z = 450）。进一步对残基 195 进行饱和突变发现，Y195G 突变体显著增加了 9 的产量。
通过结构测定确定 9 为林可酰胺的 S - 乙酰胺衍生物，氧同位素标记实验表明分子氧是该反应的氧源。
对比 CcbF Y195N 和 Y195G 模型的对接和分子动力学模拟，发现 Y195G 中半胱氨酸部分的羧酸盐更稳定地位于 Tyr195 被 Gly 大到小取代所产生的空间中，且 Cα - H 键垂直于 PLP。
基于这些结果，构建了基于 CcbF Y195G 的多位点突变体，发现 CcbF Y72L/Y195G/Y226F 和 Y72L/Y195G/Y292A 突变体完全将反应选择性转变为 β - 消除反应，将 CcbF 的催化功能转换为 LmbF 的功能，突出了 Tyr72′、Tyr226 和 Tyr292′在控制酶反应第二步（Cα - H 脱质子后的反应选择性）中的作用。
（三）LmbF 的定点突变研究
对 LmbF 的 Leu83′、Trp150、Asn205、Phe236、Lys270 和 Pro302′引入突变以改变其反应选择性。体外酶反应结果显示，除 L83Y 和 F236Y 突变体分别显示 21% 和 58% 的活性外，大多数突变体的 β - 消除活性丧失或大幅降低（与野生型相比小于 10%）。
尽管 LmbF 在 Leu83′、Asn205、Phe236 和 Pro302′的多位点突变大多仅降低或消除 β - 消除活性，但 LmbF L83Y/F236Y 突变体除了 β - 消除反应外，还催化脱羧偶联的氧化酰胺化反应产生 9。
进一步的三突变和四突变体，如 LmbF L83Y/N205Y/F236Y、L83Y/F236Y/P302Y 和 LmbF L83Y/N205Y/F236Y/P302Y 突变体，降低了氧化酰胺化活性，表明半胱氨酸部分的细微构象差异对 LmbF 利用分子氧至关重要。
（四）LmbF 和 CcbF 的反应选择性分析
