EZH1调控胚胎发育时期HSC分化能力

造血干细胞（haematopoietic stem cells, HSCs）分化形成造血系的细胞(Orkin and Zon, 2008)。胚胎发育过程中，最原始状态的祖细胞首先出现在E7.5，随后分化形成红细胞系祖细胞、髓系祖细胞和淋巴系祖细胞，进而继续分化形成全部的造血系细胞类型。本研究主要分析了组蛋白修饰在胚胎时期HSC分化过程中的作用，证明EZH1对HSC以及后代淋巴系分化的抑制作用。EZH1是PRC2复合体的组成部分，能够催化H3K27位的组蛋白甲基化，一般认为这个位点的组蛋白甲基化能够抑制转录的进行。

备注：

5F细胞：通过5个转录因子的激活，激活iPSCs中CD34表达的表达形成CD34+ cells；转录因子分别为：HOXA9, ERG, RORA, SOX4和MYB。这些细胞具备HSCs功能，能够分化形成T细胞、B细胞等造血系细胞。本研究中研究者利用5F细胞进行shRNA筛选、以及进一步改造进行细胞水平上的测序实验。

1：筛选影响HSC谱系分化的表观调控蛋白

研究者选择了20个表观调控基因（包括DNA甲基化和组蛋白甲基化相关）(Cedar and Bergman, 2011)，分别用shRNAs敲低，分析对HSC的影响（Fig.S1A-B，1A-B）。通过CD4和CD8染色，发现其中6个基因敲除会促进T细胞分化与成熟（Fig.S1A-B，1A-B），它们分别是：

EZH1，EHMT2，MBD2，MBD4，SMYD2和EHMT1。

进一步分析以上6个基因对B细胞分化的作用，发现其中只有EZH1能够同时对T细胞和B细胞起作用（Fig.1C-I），提示EZH1可能对HSC分化及下游的造血系细胞分化和成熟具有重要作用。

Figure S1

Figure 1

2：PRC2复合体催化的H3K27甲基化，调控HSC分化

鉴于EZH1是蛋白复合体PRC2的组成部分，研究者分析EZH1对HSC分化的调控作用很可能就是来源于整个PRC2的作用。分别敲低其他PRC2组成蛋白，如EED和SUZ12同样会促进T细胞分化的影响（Fig.2A-B，S2）；另外EZH1的催化结构域SET敲除也会影响这一调节作用（Fig.2C-D）。以上数据证明EZH2对T细胞以及HSC分化的调节是通过PRC2-EZH1调控组蛋白修饰达成的。

另外我们知道，EZH2蛋白与EZH1非常类似，并且都可以作为PRC2的关键性催化蛋白组成，行使催化H3K27甲基化的功能。为了分辨EZH2在HSCs分化过程中的功能，研究者对EZH2进行了类似的敲低实验。有趣的是，EZH2水平的下降几乎不会影响T细胞分化等（Fig.2，S2），暗示了在HSCs谱系建成过程中EZH2可能不会发挥功能。

Figure 2

Figure S2

3：EZH1能够直接结合和调控髓系细胞分化关键通路和蛋白

在细胞水平上，研究者针对EZH1敲低的进行了一系列测序，分析EZH1敲除对组蛋白修饰和转录事件的全局性影响（Fig.3）：

1）RNA测序；

2）开放染色质分析，transposase-accessible chromatin using sequencing (ATAC–seq)

3）ChIP-seq，H3K4me3，H3K27me3和EZH1；

分析发现：

1） RNA测序中的基因表达上/下调与染色质开放/紧缩呈现明显正相关（Fig.3d-e）

2） HSC关键性转录因子序列上，EZH1敲低后染色质开放程度更高，即可能转录更强（Fig.3f）

3） ChIP测序结果发现，EZH1与repressive (H3K27me3)，bivalent (H3K27me3+H3K4me3)，和active (H3K4me3)的修饰都可能有关（Fig.3g,S3）

4） H3K27me3的水平与基因表达密切相关（Fig.3h-i）

Figure. 3

Figure S3

4：EZH1的缺失促进小鼠胚胎发育过程中的淋巴系细胞分化，以及HSPC的移植潜能

研究者进一步在小鼠体内，胚胎发育的血管建成等过程中，分析EZH1的表达和功能。胚胎发育过程中，不同功能的组织：AGM（aorta-gonad-mesonephros）和YS（yolk sac）被选来进行RNA表达谱、和转录起始事件分析。以E10.5的野生型小鼠胚胎和卵黄囊为例，如图4A；研究者发现EZH1在YS中表达更高，而EZH2则在AGM中表达更高，提示了两个蛋白在不同器官部位、和发育过程中起到不同功能（Fig.4B）。

分别取得三种基因型（Ezh1+/+，+/-，-/-）的AGM和YS中细胞移植，检测外周血中的嵌合情况。如图4E-F，研究者发现+/-来源的细胞移植后效果最好。进一步进行二次移植，发现EZH1缺失的细胞仍旧具备比野生型更高的嵌合比例（Fig.4H）。这都证明EZH1缺失，特别是单倍体缺失（+/-）的条件下，能够促进造血系细胞的分化和增殖。

野生型胚胎的PSP（para-aortic splanchnopleura）细胞中缺少HSCs，因此移植不会成功(Dzierzak and Speck, 2008)；然而EZH1缺失胚胎（Ezh1+/-和-/-）来源的PSP细胞，在进行移植后仍旧具有外周血嵌合的功能（Fig.4G）。这证明EZH1的缺失甚至具备促进HSCs提前产生及成熟的功能。

Figure4

本文来源

Linda T. Vo., Melissa A. Kinney, Xin Liu, etc. (2018). Epigenetics of haematopoietic cell development. Nature, Jan 25;553(7689):506-510.

Reference：

Cedar, H., and Bergman, Y. (2011). Epigenetics of haematopoietic cell development. Nature reviews Immunology 11, 478-488.

Dzierzak, E., and Speck, N. A. (2008). Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature immunology 9, 129-136.

Orkin, S. H., and Zon, L. I. (2008). Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell 132, 631-644.