武汉大学殷昊团队：倍数减少脂质投入的LNP剂型设计新策略 | NSR

近年来，研究人员不断深入研究可电离脂质的性质以及其与 RNA 相互作用的机制，以进一步优化 LNP 的设计，提高 RNA 递送的效率和特异性。多项研究表明，可电离脂质分子与 RNA 之间形成的氢键等弱相互作用力有助于提高 LNP 的体内递送效率，但在 LNP 剂型中的作用尚无报道。

与商业化脂质 SM-102 相比， HTO 分子通过环氧烷开环反应使分子的一条支链上产生一个额外的羟基。同时通过改变环氧烷的碳链长度，分别得到三种新的脂质分子（ HTO12 、 HTO14 和 HTO16 ），相应分子的合成路径如图 1 所示。随后，通过分子动力学模拟发现羟基数量的增加显著增强了脂质分子和 mRNA 分子之间的相互作用力（图 2 ）。

图 1 HTO 脂质分子的合成路径

图2 分子动力学模拟图。（A）SM-102和（B）HTO12

研究人员将 HTO 脂质分子、 DSPC 、胆固醇和 DMG-PEG2000 按照摩尔比 50 ： 10 ： 38.5 ： 1.5 与表达萤火虫荧光素酶的 mRNA （ Luc mRNA ）通过微流控装置混合，通过改变可电离脂质与 mRNA 分子的质量比制备得到相应的 HTO LNP 。研究人员发现羟基数量的增加显著提高了 LNP 的载药水平。随后分别将相应的 LNP 通过尾静脉注射至小鼠体内， 6 小时后使用活体成像系统采集小鼠活体和主要器官的发光强度。结果显示，与商业化制剂 SM-102 LNP 一致， HTO LNP 经尾静脉注射后主要富集在小鼠的肝脏部位（图 3 ）。其中， HTO12 LNP 的 mRNA 递送效率与 SM-102 LNP 相当，但此时 HTO12 LNP 中可电离脂质与 mRNA 的比例与 SM-102 LNP 相比降低了 2.5 倍（图 3 ）。

图 3 HTO LNP 制剂配方筛选

研究人员利用 HTO12 LNP 共同递送腺嘌呤碱基编辑器 ABE8.8m mRNA 和靶向小鼠 Pcsk9 基因的 sgRNA ，以降低小鼠肝脏细胞中 Pcsk9 蛋白和总胆固醇的表达水平。具体的作用机制如图 4 所示，通过将 sgRNA 设计在 Pcsk9 基因的第一个外显子和内含子的剪接位点处，干扰 Pcsk9 pre-mRNA 的正常剪接，从而产生错误的蛋白，最终实现 Pcsk9 蛋白的表达下降。

随后，将制备得到的 HTO12-ABE8.8m mRNA & sgRNA LNP 注射至野生型 C57 小鼠体内，剂量为 3 mg/kg ，两周后收集小鼠的外周血和肝脏组织进行相应的分析（图 4 ）。结果显示， HTO12 组小鼠 Pcsk9 蛋白下降了 86.6% ，总胆固醇含量下降了 25.2% 。深度测序结果表明， HTO12 组小鼠肝脏的基因编辑效率为 63.4% ，与 SM-102 组小鼠相当。

图 4 HTO12 LNP 递送单碱基 编辑工具的

综上所述，该研究设计了一种新型的多羟基可电离脂质分子（ HTO12 ），通过增强脂质分子与 mRNA 之间的氢键作用力，不仅实现了与商业化脂质 SM-102 相当的 mRNA 递送效率，同时也倍数减少了脂质的使用量。 HTO12 LNP 成功递送单碱基编辑工具，实现高水平的体内基因编辑。与此同时，更少的脂质使用量可显著降低由脂质分子引起的潜在不良反应的风险，表现出在