高分文章和基金是如何用CRISPR/Cas9的？

国自然评审工作结束了，大家静待最终大结局吧，到时候那些没过的童鞋喝几顿酒抽几包烟之后，就可以为明年的国自然以及地方的基金申请开始构思了。

功能实验中分子的过表达、敲减等，最常用的是siRNA、shRNA等，其实新技术的运用也是备受评审专家的青睐的，siRNA和shRNA问题太多，脱靶效应严重，入细胞核困难，所以在新技术的应用上，不妨多花点钱、多花点精力，开始学习CRISPR/CAS9吧，其功能强大不说，例如knockin、knockout之外还有CRISPR/i、CRISPR/a，其可用于基因的功能Screen，晚学不如早学，反正迟早都得接触。

（一）国自然CRISPR这样用，眼前一亮

来看一下往年的CRISPR基金情况，按照2016年趋势，今年的CRISPR项目会突破80项？拭目以待吧。

看看2016年的几个国自然项目标题：

1. WAS-iPSCs突变基因通过 CRISPR/Cas9 靶向修复并向 造血细胞 定向分化研究,235万；

2. 基于光遗传学和 CRISPR 技术研究组蛋白乙酰化调控Fas表达水平在维持大 肠癌干细胞 特性中的作用及机制, 17万；

3. CRISPR/Cas介导的GCPII及III基因联合剔除启 动脑损伤 后内源性神经保护的研究, 57万；

4. CRISPR 靶向导入SDF-1调控BMSCs促进 眼眶骨再生 及其机制探讨, 18万；

5. 利用 CRISPR 技术探索Nrf2抗氧化通路在低氧诱导 肺癌转移 中的作用及机制, 18.5万；

6. 基于 CRISPR/Cas9 基因组定点编辑技术的成年小鼠 肝癌 模型建立,95万；

7. CRISPR/Cas9介导的miRNA敲除诱导肺转移中处于休眠状态的 肝癌细胞 发生再激活的机制研究,17.5万

8. CRISPR靶向调控HDAC9在 骨髓基质干细胞 治疗股骨头坏死的作用,51万；

9. 基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除TRIM37泛素化连接酶基因治疗 乳腺癌 的实验研究, 20万；

10. CRISPR/dCas9技术介导的联合基因修饰人羊膜上皮细胞治疗 糖尿病ED 的实验研究,60万；

11. 利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE-/-小型猪 动脉粥样硬化 模型, 110万 ；

12. 通过CRISPR-Cas9介导建立可诱导的条件性敲除小鼠模型, 58万；

    。。。。。。

    Crispr技术的效率高准确度高的特点，使得项目更具创新性。

    
    

（二）拿到基金后，CRISPR可以这样玩

今天小编就给大家分享几篇CRISPR/Cas9的文章以及国自然基金，解剖麻雀，给人一种“这样做实验，想发低分都难”的感觉。

CRISPR应用多多，knockin、knockout、CRISPR/i(抑制)、CRISPR/a(激活)，咱们一一讲解。

1. Knockin、knockout：基因敲入、敲除——研究非编码RNA

文章举例：Molecular Cell，IF=14

基因敲入敲除技术是CRISPR应用最广泛的一种应用了，基本原理都是比较类似的，张锋 大神最开始的文章也是利用了Knockout技能。

这里分享一篇研究miRNA成熟影响因素的文章。

这篇文章中主要是研究RNA结合蛋白RBP的作用，前期工作中作者筛选得到了大量的RBP可能调控特殊的miRNA成熟，那么作者利用CRISPR技术对RBP进行敲除，检测miRNA的成熟过程是否受到影响，例如作者发现C9ORF114蛋白可以结合在miRNA前体的发夹结构上，作者对C9ORF114进行敲除，操作如下：

根据基因C9ORF114的序列信息设计sgRNA → 构建转染载体pX330-gRNA（含Cas9）(Cas9既有识别功能又有DNA切割能力) → lipo3000转染细胞 → Q-PCR、WB检测C9ORF114表达情况

2. RNAi沉默不掉lncRNA？Crispr/i可以！

文章举例 ：NUCLEIC ACIDS RES，IF=10

CRISPR可以实现在不改变基因组的情况下进行表观遗传水平的基因沉默。那为何不用基因敲除呢？

基因的deletion改变了DNA的组成，而siRNA和反义RNA介导的RNA水平沉默，都各有各的不足，而CRISPR/i提高了沉默的效率和精准度，也并没有改变DNA序列，一举两得。