撰稿 | 石决明
在这个系列的开篇词就说过，2025年版药典指导原则9203中“菌种”部分一个字都没改。
没有改并不代表没有问题，今天我们说的就是菌种传代部分的“缺失”，具体来说就是两处冲突，一点不足和一个词的翻译偏误。《中国药典》2020年版9203药品微生物实验室质量管理指导原则"工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加菌种变异的风险"。
这个要求规定了菌种传代的起点和终点，目的是控制菌种在遗传过程中出现的过度变异，因为过度变异会使标准菌株丧失标准作用。
但是，关于起点在《中国药典》2020年版通则1121抑菌效力检查法中表述却有不同：“试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代）”。干燥菌种其实就是冻干技术制作的标准菌株，按照ATCC的建议冻干菌种应储存在2至8°C，这样更便于运输和分发。
而对于冷冻菌种（注意不是冻干菌种）的长期储存，ATCC建议使用液氮的气相或-80°C的冰箱。菌种保藏机构必须具有这样的硬件条件，而且要有完整的菌种追溯流程和菌种确认程序，才可以保证菌种在菌种保藏中心保藏期间的变异较小。
从这个意义上来说，并不是大大小小的保藏机构都具有这样的水平。能够提供一份详细的COA是最基础的要求，更好的方式应该是纳入供应商管理，甚至可以去现场审核。
所以，0代是人为划定的起点，只能是认可的保藏机构的菌种。可以说0代是一块金字招牌，代表对保藏机构品质的认可，相当于“嫡系”。
而任何商业公司使用菌种保藏机构的标准菌株制作的培养物，无论名称是控制菌株、标准培养物、测试菌株还是质量控制菌株，都是派生菌种，相当于“旁支”。其COA上必须注明由菌种保藏机构的标准菌株传代几次制作而得。这就是指导原则9203中提到的“或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。” 
为了更清楚说明传代控制，指导原则9203中补充了传代的概念：“1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何形式的转种均被认为是传代1次。”在实际传代判断中，我们还会对“新鲜培养基”和“接种行为”的尺度区分存在困难。对于微生物来说，很多东西都可以算培养基，比如水、冻干菌种的复融液等等。 上图中是微生物学历史上比较有名的彷徨试验，这个实验室为了说明自然突变的存在。但是如果从变异的角度去说：培养前分装到50个小培养管这个操作使变异率有所提高。换句话说，就是改变了培养状态就会提高变异情况。我们可以得出结论：只有生长（或者说产生分裂），才会产生变异。（这里必须停下来，思考1分钟。正是因为繁殖快，微生物的遗传特性才得以明显表达，微生物才更能适应外界环境压力的变化。）那既然变异可能很容易就出现，那微生物转接到水中算不算一次传代呢？比如冻干菌种的重新水化或者复融。 传代是菌种变异风险比较大的行为，中国药典中的描述存在不足，无法进行清晰界定。而传代定义在USP<1117>微生物最佳实验室实践中为：“一次传代被定义为将微生物从活性培养物转移到新鲜培养基中，并且微生物生长。任何形式的亚培养都被视为转种/传代。”这就在新鲜培养基的判断标准之外又加上了培养结果的判断。别小看多这半句话，非常重要。
USP<71>无菌检查中要求：“not more than five passages removed from the original master seed-lot”。相应的中国药典指导原则9203中表述，工作菌株的传代次数不得超过5代。
“passage”是“传代”并不是“代”，中国药典中的表述让我们很容易混淆“传代”与“代”的概念，日常使用中经常就会听到“这是几代菌”这样的表述。而细菌的二分裂一次其实也就是十几分钟，5代也就1小时的事情。不信请盯紧下面动图看看。 
再加上很多文件中又推荐区分储存菌种和工作菌种。这样确定在标准菌株之外的传代次数时会存在一些困惑。 根据《2023药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统》中的菌种传代示例图，我们可以标记上“传代1次”的标签，这样我们就很容易统计一共经过了多少次的传代。
“5代之乱”的迷宫：设计一个迷宫游戏，迷宫的路径代表菌种的传代过程，终点是一个标有“5代限制”的出口，迷宫中的障碍可以代表传代过程中可能遇到的问题。
实力所限，做不出来。大家可以想象一下哈
🤔至于为什么是传代5次的限制？这在ATCC的技术报告中有详细的描述，推荐大家去延伸阅读。 综上所述，虽然《中国药典》2025年版中指导原则9203中菌种部分没有任何修改，但是细节部分有很多与国外标准存在差距和不同。两处冲突会不会统一描述？半句话的结果判断会不会加上？5代还是5次传代？
互动问题：
1. 你如何看待0代菌种的“金字招牌”？是否认为这是一种有效的品质保证方式？
2. 在你的实验室中，是如何区分“新鲜培养基”和“接种行为”的？有没有遇到过什么困难？
3. 你认为传代5次的限制是否合理？有没有遇到过超过5代的菌种变异情况？
4. 你如何看待商业公司使用菌种保藏机构的标准菌株制作的培养物？是否认为这是一种可靠的质量控制方式？
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从事微生物相关工作15年以上，做过体外诊断产品研发、成品培养基质量保证、产品仪器环境验证管理、药品微生物相关检验和洁净环境检测。一直在各个网络平台解读微生物基础知识的现代应用和微生物前沿知识的分享，致力于做接地气的微生物知识分享，说点不一样的微生物，对药品微生物检验技术有很多独到的见解和想法。 更多精彩内容也可关注：
