国自然申请 | 重要注意点：细胞水平实验，怎么设计才算严谨？——如何选择合适的细胞？

在国自然项目中， 细胞实验 一般都是必选项，在功能和机制实验中通常都要涉及。但 越是“常规”实验，设计严谨就越难 ，下面就尽量详细说明要考虑的因素。

一、如何选择合适的细胞？

细胞的选择是设计要考虑的第一步，有了合适的细胞才能构建疾病模型，进而对我们关注的“基因”或者“药物”进行干预：比如对基因进行沉默、过表达操作，药物处理等等。但是， “ 没有说明为何选择某某细胞 ”是国自然项目中评审专家常常指出的设计漏洞 。

简单来说，根据细胞的获取方式一般我们分为这三类： A. 细胞系（或者永生化的细胞）； B. 原代细胞；和 C. 分化诱导的细胞。

细胞系（或永生化细胞）在肿瘤研究和非肿瘤研究中都常用，主要看细胞系的来源。肿瘤研究中不管是单独研究肿瘤细胞的增殖、转移、耐药等问题，还是与肿瘤微环境中的免疫细胞通讯等都是常用手段。需要注意的问题有几个：

比如 肿瘤细胞系与病理分型要对应 ，肺腺癌 vs 肺鳞癌 vs 小细胞肺癌，所用细胞系不同（ A549 、 H1299 等为肺腺癌细胞系， NCI-H520 为肺鳞癌细胞系，而 SHP-77 为小细胞肺癌细胞系）； HepG2 细胞系为肝母细胞瘤细胞系，而研究原发性肝癌用 Huh7 、 Hep3B 以及 MHCC97H 等更为严谨。

再如 细胞系的遗传背景 也要考虑：同为肺腺癌细胞系， A549 和 H460 为 p53 野生型（ WT ），而 H1299 为 p53 缺失、 H1975 和 HCC827 为 p53 R273H 突变（ P53 的热点突变），如果恰巧研究选的是 H1975 和 HCC827 ， 严格来说结论就只能限定在 p53 R273H 突变性肺腺癌，而非广义的肺腺癌 。 当然，要与临床问题对应需要有现成的细胞系可供选择， 如果实在没有就要考虑自建细胞系或者在已有细胞系上改造构建。

A 2. 细胞系要与临床问题对应

比如研究淋巴结转移、脑转移等问题时， 如果没有淋巴结转移、脑转移专门的细胞系，一般就会从现有细胞系 建立动 物模型从淋巴结组织、脑转移灶筛选构建 ； 当然另外一个策略是从细胞系出发，关注转移灶大小和数量，但创新性略差；

再比如研究肿瘤耐药，虽然分为原发性和继发性耐药，大家关注更多的是继发性耐药， 因此一般从耐药细胞株的构建开始，虽然 筛选耐药细胞株比较耗时且长期培养会丢失耐药性 。

A 3. 细胞系与研究基因对应

先说一个常见的观点： 如果 A 基因在肿瘤高表达，在肿瘤细胞系就要做敲降 / 敲除；如果低表达，就要做过表达 。 这个观点是片面甚至是错误的，原因在于没有搞清楚两个问题：

Q1 当 A 基因高表达时 , 为什么要做 A 基因的沉默（ KD/KO ） ?

Q1 ：如果 A 基因高表达，促进肿瘤发生发展； A 基因沉默后，肿瘤发生发展被抑制，说明 A 基因可以作为药物治疗的靶点，对开发靶向 A 的药物治疗肿瘤有理论支撑；

Q2 在细胞层面要对 A 基因进行沉默或者过表达，要考虑真正因素是什么？

Q2 ： A 在 不同细胞系中的本底表达有高有低，表达高的细胞系做沉默 （ KD/KO ） ，表达低的细胞系做过表达 。

因此，在对 A 基因做沉默和过表达之前， 应先检测不同细胞系的表达量，然后选择高表达的细胞系做沉默（KD/KO）、选择低表达（或者无）的细胞系做过表达。 而且，为了排除脱靶效应（ shRNA 、 sgRNA 等都有脱靶效应）， 还要有沉默（KD/KO）+过表达、以及沉默（KD/KO）+显性失活突变（Dominant Negative） 。

当然还有几个注意事项，就不展开说了，比如先前报道过的“ 细胞系污染和用错 ”的问题：

再比如 有的细胞系的生长特征为成簇生长，几乎没有迁移运动能力，但是文章和基金中做 Transwell 侵袭迁移实验的大有人在 ，如果真碰到懂行的专家， 是有可能上升到学术诚信问题的 ！

除了这个几个问题外，细胞系（或者永生化的细胞）也常用于非肿瘤研究，比如平时我们用的最多的两种“巨噬细胞” RAW264.7 （小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系）和 THP-1 （人单核细胞白血病细胞系， THP1 诱导为巨噬细胞后使用）。 需要注意的是由于 细胞系（或者永生化的细胞）在功能特征上有一定的肿瘤样特性，与组织内的巨噬细胞有一定的差别，这就使得原代细胞成为国自然项目中必要且必需有的一部分内容。

与细胞系相比，获取原代细胞的难度更大， 但由于更贴近病灶组织的病理状态，因此是好的研究和国自然项目中必备的 ， 而“缺少原代细胞验证”正是最常见的研究设计缺陷之一。因此原代细胞的验证是必须的。 反之， 如果能提供原代细胞分离和鉴定的数据（比如形态图、免疫荧光染色等“漂亮高端”的图），也是给预实验加分的地方 。

当然，如果从组织（特别是小鼠）中获取的原代细胞量太少，少到只能做分析，而不能培养做功能实验的时候，就要考虑下一个选项——分化诱导了。

从 iPSC 等细胞进行定向诱导分化，以得到足够量的用于功能实验的细胞。实际上， 分化诱导细胞 的策略与原代细胞在技术路线上还有一个很大区别：

原代细胞可执行“ 建疾病的动物模型——分离细胞——指标检测 ”的技术路线，即 先动物建模，再分离细胞 ；

而诱导分化细胞则走“ iPSC 等诱导细胞——建立疾病的细胞模型——指标检测 ”的技术路线，即 先获取细 胞，再建 疾病模型 。

同样的道理， 如果能提供 iPSC 定向诱导分化好的的数据（比如形态图、免疫荧光染色等“漂亮高端”的图），也是给预实验加分的地方。

另外， iPSC 定向诱导分化的细胞虽然少用，但在特定研究中具有不可替代性。

——未完待续