泛癌可变剪切30分思路分享

可变剪切的失调与许多人类疾病密切相关，了解转录物剪切的遗传变异对解析癌症的分子机制至关重要。 因此，可变剪切也是癌症研究的热点方向。生信人早在四五年前就开始推出可变剪切相关的分析思路及方法。小编今天再和大家分享一篇 23 年 11 月 发表在 GASTROENTEROLOGY(IF:29.4/Q1) 杂志上关于 可变剪切的文章。该文章全面分析了剪切 数量性状位点 (sQTLs) 在癌症中的功能，并重点 分析了 其在结直肠癌 (CRC) 中的独特作用 机制。 时隔几年可变剪切仍能发 30 分，可见可变剪切热度不减。长话短说，小编今天就带大家一睹为快。

Genetic control of alternative splicing and its distinct role in colorectal cancer mechanisms

可变 剪 切 的遗传控制及其在结直肠癌中的独特作用 机制

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一．文章摘要

研究对 TCGA 泛癌样本 进行了全面的 sQTL 分析，识别出 33 种癌症中控制信使 RNA 剪切的遗传变异，并对 154 例结直肠癌 (CRC) 样本进行了 独立验证。 此外，研究也纳入了大规模、多中心、多种族的病例对照样本，对识别的关键 sQTIL 与 CRC 风险的相关性 进行分析。最后研究也进行了一系列体外和体内生物学实验，分析并验证候选 sQTL 和靶基因的潜在机制。 最终研究揭示了 sQTL 的分子特征及 其在肿瘤易感性中的独特作用。

二．文章的主要内容及结果

1.33种癌症剪切数量性状位点图谱的功能特征

研究首先在泛癌中分析了sQTL的功能特征。 研究 使用 TCGA 数据， 识别了 33 种癌症的 9026 例肿瘤样本中的 168,694 个 可变剪切 ( AS) 事件和 4,599,598 个 sQTL( 图 1A) 。 研究观察到随着样本量的增加，剪切事件和 sQTL 的数量也 稳步增加 ( 图 1B) ，这意味着 新的剪切事件和 sQTL 仍有待发现。研究也观察到癌症特异性 的 sQTL -AS 对占总对 数 的 51.86% ，这意味着它们在不同癌症中具有独特的调节作用 ( 图 1C) 。 研究通过位置富集分析也观察到 sQTL 在外显子区域显著富集 ( 图 1D) 。 研究也注释了 sQTL 在不同调控层面的分子特征，结果发现在启动子和增强子 等调控区域 sQTL 显著富集 ( 图 1E) 。在本分析中包含的所有 研究分析了 59 个转录因子 ( TF) ， 观察到 NRF1 、 MYC 和 MNT 优先结合 sQTL( 图 1F) 。 研究也观察到 sQTL 在 RNA 结合蛋白 (RBPs) 的结合位点富集 ( 图 1G) 。此外， 研究也发现 只有 16.8% 的 sQTL 影响整体基因表达 ( 图 1I) ，表明基因表达和剪切事件的独立调控。此外，多种癌症中 表达数量性状位点 ( eQTL) 和 sQTL 在 GWAS 信号中 都便显出 了过量的低 P 值 ( 图 1I) 。 研究也发现 在检测的 13 个性状中， sQTL 和 e QTL 分别解释了约 0.37%-9.47% 和 1.01%-8.78% 的遗传力 ( 图 1J) 。

图 1 33 种人类癌症类型 sQTL 的识别和功能刻画

2.sQTL靶向基因增强了对生物学过程的解释

研究接着对sQTL的靶基因进行了分析刻画。 研究识别了 sQTL 的靶基因 ( sGenes ) ，并观察到其 在多种癌症相关通路 ( 图 2A) 和突变基因 ( 图 2B) 中富集。 sGenes 还 被发现具有大量的扩增和缺失负荷 ( 图 2C) 。 此外，研究也 观察到 sGene 的表达与 CD8+ T 细胞和调节性 T 细胞等免疫细胞的浸润密切相关 ( 图 2D) 。 研究也基于药物敏感性基因组学数据识别 了 29,924 对 sGene-drug( 图 2E) 。

图2 sGenes的特征分析

3.中国结直肠癌患者剪切数量性状位点分析

研究接着对结肠癌的sQTL进行了重点分析。 研究收集了来自中国人群的 154 个结直肠肿瘤和配对正常组织，并构建了首个 sQTL 图谱 ( 图 3A) 。研究识别出 11 个优先结合到含有 sQTL 区域的 RBPs ，其中包括几个剪切 因子 ( 图 3B) 。 研究也观察到肿瘤组织中多数 sQTLs 与 eQTLs 具有显著差异 ( 图 3C) ， 且 eQTLs 与影响同一基因的 sQTLs 之间的距离较大 ( 图 3D) 。此外， 这两类 QTL 也 在 CRC 的 GWAS 中 表现出 了过量的低 P 值 ( 图 3E) 。 研究也发现了 32 个在肿瘤特异性 sQTL 中富集 更强的 RBPs ( 图 3F) ，这些 sQTL 也 在 CRC 中显著上调 ( 图 3G) 。 此外，研究还观察到与正常特异性 sQTL 相比，亚洲人群中 CRC 相关变异富含 CRC 特异性 sQTL( 图 3I) 。 研究也观察到 使用 eQTL 或 sQTL PRS 的风险分层 更好 ( 图 3J) 。

图3 中国结直肠癌患者sQTL谱的验证

4.剪切数量性状位点变异rs61746794与多人群结直肠癌风险显著相关

研究接着分析了与CRC风险显著相关的sQTL。 文章首先将 sQTL( 图 4A) 与 CRC 风险的关联进行整合 ，结果发现了与结直肠癌风险最显著相关的位点 rs61746794( 表 1 和图 4B) 。研究接着将 rs61746794 在来自北京的 1524 例和 1522 例对照以及来自前列腺、肺癌、结直肠癌和卵巢癌筛查试验的 1233 例和 7398 例对照中进行进一步的 I 期复制，并发现 T 等位基因与 CRC 风险增加显著相关。在复制 II 阶段，研究也在来自武汉的 4500 例病例和 8500 例对照以及来自英国生物银行的 5246 例病例和 31476 例对照中验证了这种显著相关性。最后，研究将发现和复制阶段的结果结合起来，发现 rs61746794[TT] 基因型仍与亚洲和欧洲人群中 CRC 风险增加相关 ( 表 1) 。

表1 个体单核苷酸多态性与三期及联合样本结直肠癌风险的相关性分析

5.剪切数量性状位点变异rs61746794 T等位基因促进PRPF8介导的PRMT7外显子16剪切

研究接着对rs61746794 T等位基因相关外显子进行了分析。 研究 根据 Ensembl 数据库 (GRCh37) 的注释和 TCGA SpliceSeq 的分析结果，观察到 人类 PRMT7 基因模型共包含 20 个外显子，主要可以拼接成 28 个转录本。其中有 6 个转录本参与 AA_exon 16 剪切 事件，分别记为 PRMT7-V1 至 PRMT7-V6( 图 4C) 。 研究接着发现 rs61746794 的 T 等位基因与 TCGA 和 该研究 数据中 PRMT7 外显子 16 的替代受体位点密切相关 ( 图 4D 和 E) 。 研究也发现 当 rs61746794-C 等位基因转变为 T 等位基因时， PRMT7 外显子 16 受体位点产生了更强的信号 ( 图 4F 和 G) 。

图4 rs61746794可能改变CRC中PRMT7外显子16剪切的功能性sQTL

接着研究试图分析 rs61746794 等位基因特异性活性的潜在机制。 根据 ENCORI 数据库 结果研究发现 PRPF8 特异性结合 PRMT7-V1 和 PRMT7-V2 中含有 rs61746794 的区域 ( 图 5A) 。此外， 研究 使用 RBP 免疫沉淀和 RNA 拉下实验验证了 PRPF8 与 rs61746794-C 相比，主要结合在 rs61746794-T 区域 ( 图 5B 和 C) 。多个数据集 中也都观察到 与正常组织相比， PRPF8 在肿瘤组织中显著过表达 ( 图 5D) 。 研究也在 TCGA 和自己的数据中观察到， PRPF8 的表达与 CRC 中外显子 16.1 的包含水平呈负相关 ( 图 5E) 。此外， PRPF8 的表达水平与 PRMT7- v1 的表达呈负相关，而与 PRMT7- v2 的表达在群体 ( 图 5F) 和细胞系中呈正相关。 研究也观察到 PRPF8 的敲低 会 导致 PRMT7 外显子 16 的 剪切 信号显著减弱 ( 图 5G 和 H) 。

图5 PRPF8优先结合rs61746794-T等位基因，促进致癌PRMT7剪切

6.PRMT7亚型通过催化H4R3和H3R2甲基化增加结直肠癌的风险

文章最后分析了PRMT7亚型增加CRC风险的机制。 研究发现 MT7 作为一个潜在的致癌基因 能够 促进 CRC 的进展 ( 图 6A 和 B) ，与正常组织相比 PRMT7_AA_16.1 的 剪切百分比在肿瘤组织中也 显著下调 ( 图 6C) ，这表明外显子 16.1 的 剪切 可能与 CRC 的发展有关。 因此，研究通过实验验证发现 与 PRMT7- v1 或对照载体相比， PRMT7-V2 过表达 会 显著增强细胞增殖和集落形成能力 ( 图 6D 和 E) 。 研究也观察到 在体内过表达 PRMT7-V2 的异种移植物的生长明显高于 PRMT7- v1 和对照 ( 图 6F) 。 此外， 与 PRMT7- v1 过表达的细胞相比， 研究 在 PRMT7- v2 过表达的细胞中 识别 了 72 个显著差异的甲基化肽，代表 49 种独特的蛋白质， 其中包括 组蛋白 H3(R9) 和 H4(R20) 肽的甲基化信号 ( 图 6G 和 H) 。 研究通过实验检测到 已知的 PRMT7 底物，如 DDX23 和 CALM3 ， 并观察到 PRMT7-V2 过表达细胞中 H3R2me2s 和 H4R3me2s 的修饰均有所增加，但 H3 和 H4 未见明显变化 ( 图 6I) 。为了进一步确定 prmt7 依赖性组蛋白甲基化的转录调控作用， 研究 进行了 RNA 测序，结果显示经典致癌信号通路中基因的转录发生了广泛的变化，包括 YAP 、 AKT 和 KRAS 通路 ( 图 6J 和 K) 。

图6 PRMT7亚型通过激活组蛋白精氨酸甲基化促进结直肠癌细胞增殖