Plus深读 | Nature：mRNA尿苷化修饰是如何影响哺乳动物转录组形成的？

2014年，首尔国立大学的科学家鉴定得到了TUT4，TUT7作为mRNA尿苷化转移酶，介导mRNA 3’尿苷化。他们发现：在人体内，尿苷化介导mRNA降解的模式图如下图（1），poly(A)尾巴缩短是mRNA降解的启动标志，当poly(A)尾巴缩短到约27个核苷酸时，poly(A)结合蛋白脱落，随后招募尿苷化转移酶TUT4和TUT7介导mRNA 3’尿苷化，U-tail随后被下游的降解因子识别，导致mRNA降解²。

卵泡发育阶段是指由原始卵泡发育成为初级卵泡，次级卵泡，早期窦卵泡，晚期窦卵泡以及排卵前卵泡的生理过程。这一过程中伴随着细胞形态和细胞大小的变化，如图（2a）所示。在生长卵泡阶段，母源mRNA是非常稳定的，但是每个阶段的生长卵泡都具有不同的转录组，这表明生长卵泡不仅能够聚集mRNA而且能够选择性介导其部分mRNA的降解。生长卵泡如何清除转录本以保证mRNA的剂量从而形成功能性母源转录组的机制仍然是未知的。

图1 依赖于尿苷化的mRNA降解模式图²

来自英国爱丁堡大学MRC Centre for Regenerative Medicine的Dónal o’Carroll课题组在Nature发表了题为“mRNA 3′uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome”的文章。文章首次报道了尿苷化在小鼠卵母细胞发育过程中的生理功能，描述了由TUT4和TUT7介导的mRNA 3´末端尿苷化导致卵母细胞发育过程中的转录本降解，从而形成母源转录组。揭示了poly-A尾巴的长度和3'末端的尿苷化在形成母源转录组上具有的重要和特殊功能。

首先研究人员通过构建TUT4/7^HA-GFP小鼠，分析了TUT4/7蛋白在卵母细胞发育过程中的表达情况，其在原始卵泡到晚期窦前卵泡均有表达，如图2所示 ：

图2  TUT4及TUT7在卵巢中的表达情况

然后研究人员利用了由2014年韩国科学家开发的TAIL-seq技术，TAIL-seq能够同时检测poly-A尾巴的长度及3'末端核苷酸的修饰情况³。 样品包括GV期卵母细胞、体细胞和组织，通过测序分析各个样品poly(A)尾巴长度的分布以及mRNA 3' 端尿苷化的情况。在78个核苷酸的观测范围内，卵母细胞的ploy(A)长度分布具有最短的模式长度（图3b）。在不同的转录组中末端尿苷化的情况也不同（图3c），GV卵母细胞的一个显著特征是具有最高的多聚尿苷化和寡尿苷化比例（图3d,e）。如图3所示

图3  Tail-seq鉴定poly(A)长度及3' 端尿苷化的情况

在了解了卵母细胞3'末端核苷酸的修饰情况之后，为了研究TUT4/7介导的尿苷化在卵母细胞发育过程中的生理功能，研究人员构建了TUT4 fl和TUT7 fl小鼠，并通过与Zp3-cre工具鼠交配繁殖得到TUT4^fl/fl;TUT7^fl/fl;Zp3-creTg⁺,作为下文中的实验组TUT4/7^cKO,其能够在次级卵泡阶段敲除目的基因⁴，而交配繁殖得到的TUT4^fl/fl;TUT7^fl/fl作为下文中的对照组TUT4/7^CTL。这与一般大家研究母源因子在卵母细胞发育及早期胚胎发育过程中功能机制的思路是一致的。研究人员通过繁殖率检测发现TUT4/7^cKO条件性敲除的小鼠不育（图4a），但是能排出正常数量的卵母细胞（图4b），只是SN型卵的比率下降（图4c）。为了研究突变的卵母细胞发生缺陷的原因，研究人员对TUT4/7 ^CTL和TUT4/7 ^cKO母鼠注射激素超排后与野生型公鼠合笼，输卵管冲出合子，体外培养观察附植前胚胎发育情况。TUT4/7 ^CTL能够发育到囊胚，TUT4/7 ^cKO发育不能超过2-细胞胚胎阶段（图4d）。这样的表型可能是卵母细胞第一次减数分裂异常，产生了异常的MII期卵母细，也可能是第一次减数分裂正常，但产生的MII期卵母细胞无法支撑受精的完成。为了确定缺陷发生的阶段，研究人员对TUT4/7 ^CTL和TUT4/7 ^cKO母鼠注射激素，从卵巢卵泡中分离GV期卵母细胞，体外培养后进行免疫荧光染色，观察表型。研究人员观察到卵母细胞不能正常完成第一次减数分裂，其异常表型包括纺锤体形态异常伴随着星状体形状的微管，第一次减数分裂末期阻滞，异常的MII期卵母细胞伴随着染色分散在纺锤体周边（图4e），如图4所示：

图4  TUT4/7 ^cKO不育及卵母细胞缺陷

因为作者目的是研究尿苷化这种修饰对卵母细胞发育的作用，所以下一步作者则想探究TUT4和 TUT7的尿苷化转移酶酶活性是否是出现上述表型的重要原因。研究人员利用了Tut4/7^cAAD小鼠。本小鼠是基于TUT4催化三联体的突变（DDD to AAD ），这样可以使TUT4的催化活性失活，以此构建了一个TUT4^AAD的转基因老鼠，然后交配得到TUT 4^fl/AAD;Tut7 ^fl/fl;Zp3-cre Tg⁺ ，作为实验组Tut4/7^cAAD 小鼠，这样的小鼠在卵母细胞发育过程中仅能表达单拷贝失活的TUT4 蛋白。因为具有单拷贝剂量正常TUT4蛋白的表达就能使卵母细胞发育正常，用这个小鼠就能来检验是否是尿苷化转移酶活性的消失导致的研究人员发现的表型。如图4所示，Tut4/7^cAAD与TUT4/7  ^cKO表型一致。那么到这里我们可以说研究人员验证了TUT4/7的尿苷化转移酶活性对于卵母细胞完成第一次减数分裂，产生具有功能的MII起卵母细胞至关重要。

为了探究TUT4/7条件性敲除的表型与母源转录组缺陷之间的关系，组学分析必不可少。研究人员对TUT4/7^CTL和TUT4/7^cKO小鼠的GV期卵母细胞进行了转录组测序，分析了实验组和对照组差异表达的基因（图5a）。为了进一步研究差异表达的基因与卵子发生的关系，研究人员对得到在卵子发生过程中TUT4/7缺失导致的上调基因进行基因富集分析，找到在卵子发生过程中下调或上调表达的基因（图5b）。所以说，TUT4/7，特别是它们尿苷化活性参与到了卵母细胞发育过程转录本的降解过程中。本质上，他们促进了功能性母源转录组的形成。下一步研究人员想探究为什么一部分特定的转录本在卵母细胞发育过程中受到TUT4/7介导的尿苷化的调控。为了这一目的，研究对人员TUT4/7^cKO 及TUT4/7^CTL的GV期卵母细胞进行TAIL-seq，分析TUT4/7介导上调基因和未变化基因的末端poly(A)及3'末端核苷酸修饰情况。TUT4/7缺失后，上调的基因具有短的poly(A)尾巴的比例上升，表明降解转录本失败后导致短的poly(A)尾巴转录本的聚集（图5c）。相比于对照组，TUT4/7缺失后，表达上升的转录本没有发现寡聚尿苷化（图5d）。具有短的poly(A)尾巴的转录本寡聚尿苷化和单尿苷化的高比例也是完全依赖于TUT4/7的功能的，在（图5e）中TUT4/7^cKO相比于TUT4/7^CTL比例下降。所以在GV期卵母细胞中，敲除TUT4/7后，由其介导的寡聚尿苷化的消失导致了短poly(A)尾巴转录本的聚集。具体如图5所示。

图5  poly(A)尾巴长度和TUT4/7介导的多聚尿苷化降解母源转录本

为了防止其他科学家argue表型出现的原因是由于RNA中枢降解途径缺失，而这样的异常甚至在任何组织和细胞类型中都会出现。这一问题也可能是表观转移酶类和转录因子重要的区别之一，因为表观因子往往具备广谱的表达。研究人员试图进一步证明TUT4/7介导的尿苷化是否是mRNA降解的一个普遍调节因子。为此，研究人员利用tamoxifen诱导型R26^ERT-cre小鼠，通过与TUT4^fl,TUT7^fl交配得到Tut4 ^fl/fl;Tut7 ^fl/fl;R26^ERT-cre/+作为实验组，Tut4^+/fl;Tut7+/fl;R26^ERT-cre/+作为对照组，以此更广泛的研究TUT4/7缺失在细胞系和组织中的功能。研究人员进一步对肝脏细胞，骨髓细胞，成纤维细胞，胚胎干细胞进行了TAIL-seq，以观测末端mRNA尿苷化情况，发现TUT4/7的缺失并没有严重影响各个细胞类型转录组中poly(A)尾巴长度的分布（图6a）。与卵母细胞相反的是，TUT4/7的缺失对miRNA的表达水平的影响也很小（图6b）。TUT4/7的缺失，伴随着转录本尿苷化的减少以及整体miRNA水平微小的变化对分析的细胞类型和组织的基因表达变化没有明显的影响（图6c）。所以，TUT4/7介导的尿苷化对于体细胞中mRNA的降解不是一个重要的因素。但是由于TUT4/7广泛表达，不能排除在超越稳态，在体细胞受到压力应激时，由TUT4/7介导的尿苷化是否具有功能。

   图6 在不同组织和细胞系中TUT4/7介导的RNA尿苷化没有影响表达

总结

该篇文章通过利用TAIL-seq技术对组织，细胞和卵母细胞的3’末端尿苷化和poly(A)尾巴长度进行了详细的特征分析，并利用小鼠模型从体内研究3’末端尿苷化和poly(A)尾巴长度对母源转录组形成这一重要生理现象的重要作用，从而说明poly(A)尾巴的长度对于定义和激活母源转录组都具有重要作用，进一步拓展了表观修饰领域的研究思路，说明RNA表观修饰同样具备重要的生理功能。

参考文献