细胞悬浮培养技术在兽用疫苗领域的应用

1962年，Capstick等率先对BHK21细胞驯化实现悬浮培养，并用于兽用疫苗生产。1967年，Van Wezel又开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。到20世纪80年代，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体生产技术的发展极大地推动着生物反应器在生物制药行业中的应用，到20世纪末已进入万升级规模。

2000年以后，随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等技术的发展，作为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。现在，全球10000L及以上体积的反应器达一百多台，最大已达25000L，且几乎都是可以放大的机械搅拌式反应器，主要为Genetech、Amgen、BoehringerIngelheim 和Lonza等公司所拥有。2007年全球销售额最高的6大类生物技术药物中，有5类是经哺乳动物细胞表达生产的。纵观国内，人用和兽用疫苗生产企业已超过110家，应用反应器悬浮培养技术生产疫苗的仅4家。一般兽用疫苗企业采用国内自主开发的650 L和1200 L反应器生产口蹄疫疫苗。

悬浮培养技术主要包括高表达细胞株的获得、个性化培养基的研发、动物细胞反应器及配套设施的完善及生产工艺的优化等四个方面。

2.1 细胞与毒株的驯化

为提高生物制品的产率和安全有效性，在生物反应器中繁殖的病毒与细胞需要进行相互适应选择，针对不同的毒株及其表达量筛选适合的宿主细胞对于细胞大规模生产具有重要意义。

为实现驯化的稳定，通常由高密度细胞培养转向低密度细胞培养，由高浓度血清培养逐渐降低血清浓度进行培养。细胞驯化时应该注意保持细胞活力应90%以上，测定细胞增殖能力的和表达分泌能力进行，避免驯化后的细胞表达特性发生变化。驯化后细胞的增殖能力、活力及生产能力要能够满足工业大规模生产的需要。由于特定细胞的营养需求不同，实现其驯化的难易程度也不同，在驯化时需要选用合适的细胞培养基，有针对性地补充某些营养成分以满足细胞的特定需求，使驯化好的细胞可以保持其悬浮或是无血清生长的特性。

2.2 细胞培养基的个性化

在大规模培养技术中，维持细胞高密度甚至无血清生长，细胞培养基的营养含量对细胞的增殖、维持至关重要。在悬浮培养技术中，不同细胞营养代谢的特异性不同，细胞和病毒培养工艺不同，需要抗剪切力、满足放大功能，还需要提高目标生物制品的稳定性、表达量，这些均需要个性化培养基的支持。我国销售的细胞培养基却多为20世纪50年代发明的MEM、DMEM、199、RPMI1640细胞培养基等，这些目录产品难以满足生物反应器大规模培养动物细胞的技术要求，直接影响了生物制药行业技术升级。从对人类和动物安全性的长远考虑，生物制品生产越来越倾向采用无血清无动物组分培养基，因为无血清培养基杜绝了血清的外源性污染和对细胞毒性作用，使产品易于纯化、回收率高，国际上生物制药生产中，已经有50%以上采用无血清细胞培养基。

2.3 细胞培养工艺的研发

悬浮培养过程技术的开发和应用主要是生产工艺的开发和工艺过程优化，维持细胞生长和病毒繁殖的最优化环境控制，在悬浮培养技术中的作用同样至关重要。

2.3.1悬浮培养和微载体培养

悬浮培养技术按细胞贴壁性分为悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养。悬浮细胞可以在反应器中直接生产增殖，细胞自由生长、培养环境均一、取样简单、培养操作简单可控、放大方便、污染率和成本低;而贴壁细胞在反应器中悬浮培养需要借助微载体，细胞和球体接触部位营养环境较差，培养、取样观察及放大工艺复杂，成本高。

虽然相对于悬浮培养，微载体培养复杂，但与转瓶培养相比仍有很大优势，能提高生产规模、产品质量和劳动效率，因此是贴壁细胞悬浮培养的主要手段。常见的微载体有实体的Cytodex微载体、片状的DISK微载体及多孔的Cytopore微载体。使用DISK或Cytopore时细胞贴附于载体内部生长，表面细胞较少，难以使用细胞消化等方法将载体和细胞进行分离，且反应器放大工艺困难，不适合非释放病毒的培养。而Cytodex比较适应罐倒罐的反应器放大工艺，目前报道的贴壁细胞生产工艺的最佳形式是机械搅拌式反应器实体微载体悬浮培养系统，可实现最有效的优化工艺和最适宜的工艺设计，其最佳工艺设计体现于高密度连续灌流培养。

2.3.2悬浮培养方式

选择反应器悬浮培养方式需要考虑细胞和病毒的关系、产物稳定性、细胞培养基或添加物的选择、细胞培养规模等几个因素。按照培养方式分为批培养、流加培养及灌注培养。

批培养能直观反映细胞在生物反应器中的生长、代谢变化，操作简单，但初期代谢废产物较多，抑制细胞生长，细胞生长密度不高;流加培养操作简单、产率高、容易放大，应用广泛，但需要进行流加培养基的设计;灌注培养的培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，利于保持产品的活性，但操作比较繁杂、细胞培养基利用效率低、旋转过滤器容易堵塞等。不同的病毒采用的培养方式不同，如对于分泌型且产品活性降低较快的生物制品，宜采用灌注培养，且灌注培养也更适宜于微载体培养。

同一生物制品由于其营养环境的不同，其生产工艺也可能发生变化，如BHK21细胞生产口蹄疫病毒，低血清培养时采用批培养，接毒前需要更换无血清的维持液;而无血清培养过程中无需换液，配合流加培养可能效果更好。

目前疫苗免疫是控制动物传染病的重要措施之一。怎样提高疫苗质量，降低疫苗成本已成为各大动物疫苗生产企业关注的焦点。工业化细胞培养生产疫苗是提高疫苗质量，降低成本的有效手段。

3. 1 猪病毒病疫苗

狂犬病毒在2 L的生物反应器繁殖，病毒最大滴度能够达到1.38×108pfu/ mL，且生产的疫苗质量达到WHO要求。无血清微载体细胞培养有利于肠炎病毒繁殖和疫苗生产。同样有不少关于细胞培养大规模生产猪伪狂犬、猪蓝耳病、猪口蹄疫、猪瘟、猪细小病毒病等疾病疫苗的报道。

3. 2 禽病毒病疫苗

禽类疫苗主要通过SPF鸡胚生产，但鸡胚生产疫苗需要消耗大量SPF鸡胚，生产周期长，易污染，且每枚SPF鸡胚一次只能注射一个病毒毒株。因此，SPF鸡胚生产疫苗的效率很低。我国已经能够通过细胞培养生产出符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的鸡传支H120细胞弱毒苗。杨涛等也报道了禽流感病毒在MDCK细胞中大规模增殖规律。国外有不少关于细胞培养生产禽马立克病毒、传染性法氏囊病、传染性喉气管炎、产蛋下降综合征病等疾病疫苗的报道。

应该认识到，快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的应用只是搭建了一个升级工艺的平台，而不是最终目的，行业和企业发展真正的动力是新兽药、新疫苗、新工艺以及配套技术的创新。

例如无血清培养基的开发和无血清培养病毒生产技术的开发;利用合适的培养基和转染或驯化技术实现贴壁细胞的悬浮培养构建;新宿主细胞表达品种开发，例如同一种产品采用新的宿主细胞表达或是开发一种高效表达的宿主细胞适应几种产品的表达等。总而言之，整合行业力量，快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的升级换代是未来几年我国生物制药行业发展的重点。这个过程应重视成熟技术、成功率，减少和避免时间、资金、人力等资源的浪费，减少机会成本，抢占市场先机。

悬浮培养技术的升级将导致行业整合与重组，生物制药行业将出现明显的集约化趋势，有实力的企业将不断以创新新药、新技术研发为基础和核心竞争力，同时借助资金实力整合制造和营销体系，成为真正意义上的龙头。

来源：中国兽用生物制品