背景：目前用于动物细胞生长和代谢的数学模型无法模拟培养物pH值的变化及其对代谢的影响，因此无法准确模拟缺乏pH控制的培养物。然而，动物细胞培养物在没有pH控制的情况下以小规模广泛培养，例如在细胞系发育过程中用于克隆筛选。开发了一个无pH控制的动物细胞生长数学模型，并将其应用于设计无pH控制克隆筛选的最佳条件。
结果：该数学模型成功模拟了摇瓶中悬浮CHO培养的已发表数据。它还用于模拟克隆异质性，并预测不同培养条件下的相对克隆性能。分批和补料分批筛选条件下克隆滴度与pH控制补料分批之间的相关系数预测与公布的值一致。预计补料分批模式比分批模式能提供更好的筛查结果，但仅适用于能够消耗乳酸的克隆。模拟表明，筛选试验的培养持续时间对筛选结果有很大影响，最佳持续时间因克隆消耗乳酸的能力或无能而异。
结论：本研究为无pH控制的克隆选择筛选试验的优化设计提供了一种工具。
细胞生长和产物形成动力学的数学模型有助于量化和解释现有的实验数据，并预测环境条件变化的影响，已被广泛用于模拟动物细胞中的细胞代谢、生长和蛋白质表达。还提出了工业上广泛使用的用于蛋白质生产的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的动力学模型。然而，所描述的模型都没有模拟培养物pH值的变化及其对细胞生长和代谢的影响，因此可能不适合模拟pH值不受控制的条件下的培养物，如摇瓶中的培养物。Karra等人通过假设细胞生长对pH的依赖性为高斯分布，将pH对生长速率的影响纳入其中。然而，它们并不能模拟培养物pH值的变化及其对代谢的影响。在这项研究中，通过扩展先前发表的重组CHO细胞系的数学模型，开发了一种可以模拟动态变化的pH条件的动物细胞培养动力学模型，以模拟不受控制的pH条件下培养pH的变化及其对细胞生长和代谢的影响。之前已有报道使用Henderson-Hasselbach方程来模拟由于乳酸形成导致的培养物pH值的降低。为了模拟pH值不受控制的条件，该模型中同样考虑了培养物pH值的变化。本研究基于CHO、杂交瘤和PER.C6等几种细胞系的已发表数据，纳入了对细胞代谢和生长的影响。该扩展模型能够成功预测先前报道的CHO细胞摇瓶培养的实验数据。
该模型进一步用于了解不同培养条件对筛选试验在pH控制的补料分批过程中准确预测相对克隆性能的影响。用于重组蛋白生产的生产规模动物细胞培养通常在受控的pH条件下进行，pH值控制在6.8至7.15之间，并添加营养以延长培养时间。用感兴趣的基因转染后，经过三步筛选过程，获得了其大小的克隆。第一步，在多孔板中筛选数千个克隆。在第二步中，将第一步中选择的克隆以特定的细胞密度接种在培养瓶中，并在预定的培养时间后，根据细胞密度和蛋白质滴度在该筛选试验中鉴定出最佳克隆。第一和第二步骤通常在没有pH控制的情况下进行。如果不加控制，细胞培养物的pH值会因乳酸等废物代谢物的形成而降低。在第三步中，在pH控制的生物反应器中进一步严格评估第二步中选择的几个克隆的生产力，以选择最佳克隆。由于最终目标是选择最适合生产规模的克隆，因此筛选试验中克隆的相对滴度指示其在生产条件下的相对滴度以避免次优克隆选择非常重要。筛选试验期间条件的差异可能导致筛选阶段有希望的候选物被拒绝，或者对低希望的克隆进行不必要的评估。Porter等人对从96孔板到生物反应器评估的筛选过程进行了实验评估，并表明摇瓶中批处理和补料批处理评估之间的克隆性能预测存在差异。他们还报告说，在没有pH控制的情况下，通过在摇瓶中的补料分批模型中进行筛选进行克隆排名，并不能在pH控制的补料批处理过程中对克隆性能进行准确排名。Hsu等人最近还比较了四种重组CHO细胞系在ambrTM微生物反应器、2L台式生物反应器和摇瓶中的补料分批过程中的性能。他们还报告说，摇瓶中培养物的性能与ambrTM和2L生物反应器不可比。
为了了解筛选试验期间培养条件对相对克隆性能的影响，本研究开发的模型用于通过生长速率、代谢参数和比生产力的变化来模拟克隆异质性。使用相关系数将没有pH控制的不同筛选条件下克隆的（模拟）滴度与pH控制补料分批培养中的滴度进行比较。研究发现，该模型预测的不同筛选条件下滴度与pH控制补料批之间的相关系数与Porter等人报告的实验值非常一致。然后使用验证的模型模拟一些克隆消耗乳酸的能力对筛选结果的影响。预计对于能够消耗乳酸的克隆，补料分批模式比分批模式具有更好的筛选结果，但对于无法消耗乳酸的无性系则不然。模型模拟表明，在所有情况下，筛选试验的培养持续时间对筛选的预测能力有很大影响，最佳持续时间因克隆消耗乳酸的能力或无能而异。
模型能够模拟摇瓶培养的CHO细胞数据
该数学模型的开发是为了在不控制pH值的情况下模拟哺乳动物培养。我们首先评估了该模型是否能够从悬浮CHO细胞的摇瓶培养中捕获之前发表的实验数据。将模型模拟与之前报道的细胞生长、葡萄糖消耗、乳酸产生和pH的实验数据进行了比较，这些数据是在CD CHO培养基中的摇瓶中进行悬浮CHO培养，并进行补料。在模型中，通过相应地增加补料时的葡萄糖浓度来模拟葡萄糖补料。各种代谢和生长参数的值各不相同，以模拟克隆的异质性，为该克隆选择的适合实验数据的值为：μmax0 =0.029 h-1,YXG =0.3×109 cells mmol-1, mglc =24.22×10-12 mmol per cell h,YLG =0.7。所有这些值都在用于模拟克隆异质性的各自范围内。图2显示了模拟结果和实验数据。尽管克隆异质性的模拟在pH值低于6.6时终止，但该模拟仍允许在培养期间运行，以评估培养pH值的预测。令人欣慰的是，该模型能够在pH值不受控制的条件下合理地再现所报告的实验细胞生长、pH值、葡萄糖和乳酸谱。
在没有pH控制的情况下，分批筛选和补料分批筛选的相关系数相似，在5天的培养时间内最大
计算筛选试验中克隆滴度与pH控制补料批（代表生产条件）滴度之间的相关系数，作为筛选试验预测潜力的定量指标。该模型用于通过改变细胞生长、代谢和特定生产力相关参数来模拟克隆异质性，如数学模型部分所述。最终蛋白质滴度（体积生产率）被用作克隆“优度”的替代指标。使用相关系数将所有克隆在两种筛选条件下（分批和无pH控制的补料分批）获得的滴度与pH控制补料分批下的滴度进行比较。相关系数越高，表明筛选试验在pH控制的分批补料条件下预测相对蛋白质滴度的能力越强。
图3显示了当蛋白质表达与生长呈负相关或与生长速率无关时，在没有pH控制的分批和补料分批模式下的相关系数。很明显，预测该测定的培养持续时间对筛查期间两种操作模式的筛查测定的预测能力有很大影响。在评估的培养时间中，预计无法消耗乳酸的克隆的最佳选择是5天，超过5天，相关系数会降低。令人惊讶的是，如相关系数所示，在没有pH控制的情况下，批处理和补料批处理条件的预测潜力几乎没有差异。补充图S1显示，如果培养模拟没有因pH值降低而终止（这是一种生物学上不现实的条件），预计补料分批模式会比分批模式产生更好的结果。这表明，分批和补料分批模式的类似结果是培养物pH值降低的结果，而补料额外的营养素不会导致培养物寿命和蛋白质表达的增加。事实上，在所有模拟克隆中，只有2%的补料分批培养时间比分批培养时间长至少1天。
补料分批筛选对能够消耗乳酸的克隆更好
细胞消耗乳酸的能力对预测的相关系数有相当大的影响。对于能够消耗乳酸的克隆，图4显示了在没有pH控制的分批和补料分批模式下的相关系数。培养持续时间再次对筛选的预测能力有很大影响。对于长达5天的短培养时间，分批和补料分批的预测潜力相似。批量模式下的长培养时间预计会导致能够消耗乳酸的克隆的筛选结果不佳。与无法消耗乳酸的克隆相比，在补料分批模式下对此类克隆进行更长时间的筛选可以产生比分批更高的相关系数。克隆消耗乳酸的能力导致培养物pH值的自校正，从而为补料分批培养带来更好的结果。
模拟的相关系数与实验数据吻合良好
Porter等人报告了对细胞系发育不同阶段筛查结果的广泛分析。他们评估了175个在96孔板、24孔板、分批模式摇瓶和补料分批模式摇瓶中表达抗体的GS-CHO克隆，并使用最终产品浓度作为终点，对克隆在不同阶段的性能进行排名。24摇瓶分批模式评估中的前10个克隆称为“选定的前10名”。由于这些选定的前10个克隆的排名既“向后”追溯到24和96孔板评估阶段，又“向前”追溯到补料批评估阶段，因此在这些阶段可以看到排名位置的巨大差异，这表明一些在生产过程中可能表现良好的克隆可能会在筛选过程的早期被丢弃。在摇瓶中分批模式和补料分批模式评估的前10个克隆中，只有3个是常见的，这再次突显了这两种操作模式下筛选结果的差异。在随附的出版物中，作者在生物反应器中以补料分批模式评估了上述175个克隆中的29个，以直接比较在筛选过程中用于最终评估的基于摇瓶的补料分批过程中克隆的相对性能，以及在补料分批模式中受控生物反应器的相对性能。这29个克隆包括“选定的前10个”，其余的克隆被选择为涵盖从最低到最高的所有生产率值。这29个克隆的生长速率和代谢参数存在很大差异。令人惊讶的是，在“选定的前10名”中没有发现补料分批过程中的最佳克隆，这再次证明了基于分批模式的克隆选择的局限性。他们发表的图4中报告的数据用于计算摇瓶中补料批次的产品浓度与生物反应器培养物之间的相关系数为0.67。
模型预测在定性上与Porter等人的实验观察一致，即在8天持续时间的批处理模式试验中鉴定的顶级克隆在14天补料批处理试验中不是最好的。他们报告称，在没有pH控制的情况下，分批筛选和补料分批筛选的滴度之间的相关系数为0.8（r2为0.64）。作者通过对抗体浓度与整个培养期间的活细胞密度进行线性回归分析来计算比生产率，表明比生产率在培养期间可能是恒定的。为了将模拟结果与实验数据进行比较，在假设比生产率恒定的情况下，分别计算了8天和14天内未进行pH控制的批次和补料批次的克隆滴度之间的相关系数。qp=0的克隆在此分析中被忽略。对于不能或能够消耗乳酸的克隆，预测相关系数分别为0.85和0.52。Porter等人没有讨论筛选的任何克隆是否能够消耗乳酸；然而，在另一项研究中，一些克隆的乳酸产生曲线被测量，其最终乳酸浓度很高，这表明这些克隆中至少有一部分无法消耗乳酸。在这些条件下（即克隆不能消耗乳酸，蛋白质表达与生长速率无关），相关系数0.85的模拟预测接近0.8的实验结果。
此外，我们比较了补料分批与不受控pH值和受控pH值之间的相关系数预测。Porter等人发现，在摇瓶中培养14天而不进行pH控制的补料分批培养物和在具有pH控制的生物反应器中培养14天的滴度之间的相关系数为0.67。这再次与实验报告的0.67合理一致。
模型预测对参数的选择具有稳定性
如数学模型部分所述，该模型中引入的一些参数要么是特定于细胞系的，要么是以特殊方式选择的。这些方法各不相同，以评估上述趋势对这些值变化的稳健性。（a）在该模型中，YLG和YAGln值随pH值变化的临界pH值被假设为6.85：但如上所述，不同细胞系的该值可能不同。因此，通过改变这些值来评估模型的灵敏度。评估了6.9、6.8和6.7的临界pH值。（b）同样，假设乳酸消耗被触发的临界乳酸浓度也是以特殊方式选择的。还模拟了1和1.8 g L-1的临界乳酸浓度。1.8 g L-1模拟的初始碳酸氢盐浓度增加到30 mmol L-1，以防止pH值在达到临界乳酸浓度之前降至6.6以下。（c）分数细胞群的β也被模拟为能够以等于最大特定乳酸产生速率10%的速率消耗乳酸。（d）Hsu等人报告的摇瓶培养和pH控制生物反应器培养中三个克隆的数据表明，在生物反应器中消耗乳酸之前达到的最大乳酸浓度更高。通过假设触发乳酸消耗的临界乳酸浓度比摇瓶培养高1 g L-1，也对这种情况进行了评估。
在所有这些情况下，发现图3和图4中报告的趋势对变化参数值的偏差具有鲁棒性（数据如补充图S2至S8所示）。
评估最终产品滴度与代谢参数之间的相关性
如果pH控制补料批中的蛋白质滴度与任何代谢或生长参数相关，这些参数可用于指导筛选阶段最佳克隆的选择。因此，该模型用于评估最终产品滴度与不同生长、代谢和特定生产力参数之间的相关性（如果有的话）。表2显示，pH控制补料批中最终蛋白质滴度与不同代谢参数之间的相关系数不同，以模拟克隆异质性。尽管P<0.05时存在显著相关性，但表2显示相关性系数较低，表明相关性较弱。一个可能的例外是能够消耗乳酸的克隆与生长速率的相关性，该相关性比其他值大于0.6的克隆更强。与qp的相关性也很弱，尽管很显著，这与人们普遍认为的仅基于qp选择克隆不是最优的观点是一致的。
Porter等人在摇瓶补料分批培养和生物反应器培养中报告的与蛋白质滴度有显著相关性（P<0.05）的唯一参数是特定乳酸生产率。由于培养过程中特定的乳酸生产率会发生变化，因此最终乳酸浓度（或能够消耗乳酸的克隆在培养过程中的最大乳酸浓度）与整体活细胞密度的比值被用作代谢参数，称为L/I。该模型还预测了与L/I的显著相关性，尽管相关性较弱，与实验报告相似。实验数据中没有报告相关系数值。
随着测定持续时间的增加，乳酸消耗克隆的富集
转染后获得的克隆可能包括能够和不能消耗乳酸的两个克隆的混合物。该模型用于了解这种克隆混合物中前20%克隆的乳酸消耗特征。图5显示了在pH值不受控的补料批次中模拟能够和不能消耗乳酸的两个克隆的混合物时，前20%克隆中能够消耗乳酸的克隆的平均百分比。所评估的两种蛋白质表达动力学表达的趋势是相似的。能够消耗前20%乳酸的克隆百分比随着培养时间的增加而持续增加。在没有pH控制的情况下，在14天的培养期内，预计所有前20%的克隆都是能够消耗乳酸的克隆。乳酸消耗能力是生产克隆中理想的特征。在决定筛选的培养持续时间时，需要权衡筛选过程对无法在较长培养持续时间内消耗乳酸的克隆的预测能力的降低与能够消耗乳酸的无性系的可能富集。
目前报道的所有数学模型都没有模拟摇瓶培养中观察到的培养pH值变化及其对细胞代谢的影响。本研究试图弥合这一差距，以便更好地模拟pH值不受控制的小规模平台中的培养。悬浮CHO细胞系摇瓶培养的细胞生长、葡萄糖、乳酸浓度和培养pH值的模型预测与实验报告的数据非常一致，证明了该模型在没有pH值控制的情况下模拟培养的能力。
在没有pH控制的情况下，细胞系发育过程中的克隆筛选被广泛进行。Porter等人对175个克隆在多孔板和摇瓶中的各种筛选步骤中的筛选结果进行了评估，作者得出结论，分批模式的筛选对补料分批中的克隆性能没有很高的预测价值，筛选分析有很大的改进空间。我们使用本研究中开发的数学模型来评估在没有pH控制的情况下不同筛选条件对筛选结果的影响，就像摇瓶筛选一样。筛选试验和pH控制补料批中产品滴度之间的预测相关系数与实验报告值非常一致，表明该模型捕捉到了不同筛选条件下克隆行为的一般趋势。
使用这种建模方法可以帮助改进在没有pH控制的情况下进行的筛选分析的设计。有趣的是，对于无法消耗乳酸的克隆，该模型预测，在没有pH控制的情况下，分批或补料分批模式的筛查结果相似。然而，对于能够消耗乳酸的克隆，在补料分批模式下进行筛查可以获得更好的筛查结果。因此，筛选应在没有pH控制的情况下以补料分批模式进行，假设转染感兴趣基因后衍生的克隆群体可能包含在所使用的特定培养基配方和培养条件下能够和不能消耗乳酸的克隆混合物。该模型还预测，检测的培养时间对筛查结果有显著影响。因此，在实验设计过程中，应仔细选择目前没有坚实理论基础的培养持续时间。能够消耗乳酸的克隆的筛选结果非常好，对于长期补料分批筛选（>10天），相关系数预计接近0.95。然而，对于无法消耗乳酸的克隆，筛选试验的长时间培养对筛选结果不利。如果假设克隆群体包含能够和不能消耗乳酸的两种克隆的混合物，那么以补料分批模式进行较短时间的筛选试验将是一个很好的折衷方案。具体而言，对于本模拟中使用的参数范围，根据特定的蛋白质表达动力学，可以使用5至8天的补料分批培养时间，以确保筛选试验的相关系数为∼0.9。因此，使用此类模型可以帮助基于摇瓶的克隆筛选试验获得更好的筛选结果。
已经表明，克隆的乳酸消耗行为受到培养基成分的影响，尽管确切的影响因素尚不清楚。目前，克隆消耗乳酸的能力难以控制。如果未来的研究能够阐明所涉及的确切分子机制，并能够随意触发乳酸消耗，这可能会显著改善筛查结果。
该模型预测，pH控制补料批次中的蛋白质滴度与某些代谢参数之间存在显著的相关性，尽管相关性较弱。然而，相关系数表明这些相关性的强度较低，这表明这些值之间的线性关系较弱，它们不适合单独评估克隆的优劣。
与qp的相关性也被预测为较弱，这支持了广泛接受的规范，即基于qp的克隆筛查不是最优的。因此，广泛使用的最终蛋白质滴度确实是筛查分析的最佳终点。该模型可以适当地修改以应用于其他细胞系或其他培养策略，以指导针对这些情况的筛选分析设计。
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