南方科技大学陈炜/崔欢欢合作最新Nature子刊

基因转录是由DNA结合转录因子(TFs)和顺式调控元件之间的动态相互作用调节的。 TFs 由DNA结合域(DBDs)和激活域(ADs)组成，前者具有识别特定DNA基序的明确蛋白质结构，后者招募共激活剂，通常包含缺乏常规功能结构的内在无序区(IDRs)。 TFs 识别的顺式调控元件包括转录起始发生的近端启动子和远端增强子， 远端增强子通过高阶 TFs 辅激活子复合物介导的靶启动子与远程染色质环接合来增强转录。

为了操纵基因表达和重新连接内源性转录网络，已经设计了基于锌指(ZFs)和转录激活物样效应物(TALEs)的合成 TFs 。 最近，一种基于核酸酶死亡Cas9 (dCas9)的类似系统被开发出来，称为CRISPRa。第一代CRISPRa系统利用VP64 AD与dCas9融合，通过与启动子序列互补的引导RNA (gRNA)激活靶基因的转录。为了获得更高的效率，后续的改进包括修改融合AD或gRNA设计。例如，VPR系统将VP64、p65和Rta激活域融合到dCas9上进行协同激活。SunTag系统在dCas9上包含多达24个GCN4肽重复对接位点，从而通过融合的GCN4抗体向特定基因组位点募集多个激活剂拷贝。CRISPR/g RNA 导向的协同激活介质(SAM)系统利用修饰的g RNA 通过RNA配体招募多个激活域。所有这些修饰的目的都是增加目标基因组位点转录激活因子的局部浓度。 然而，这些方法通常需要多个庞大的融合伴侣，潜在地阻碍了输送，特别是在治疗应用中。

dCas9-VP64-IDR能高效特异地激活报告基因（图源自 Nature Communications ）

液-液相分离(LLPS)是一种常见的物理现象，蛋白质中的 IDR 或模块结构域(MDs)可以驱动生物分子凝聚物或无膜细胞器的形成，从而划分生化反应。 在基因转录过程中， TFs 及其共激活因子(通常包括 IDR )通过同型或异型多价相互作用调节转录凝聚物的形成。超增强子上的转录凝聚物已被证明可以驱动高活性基因的转录。此外，FUS蛋白的IDR与 TetR-VP16 的融合使相分离和转录激活增加。最近，NUP98和FUS的IDRs也被报道可以增强dCas9-VPR的转录激活电位。然而，最近的两项研究表明，优化的多价相互作用，而不是LLPS本身，增强了转录激活。 尽管LLPS在转录调控中的复杂作用仍存在争议，但利用多价相互作用为进一步开发增强的转录激活系统提供了希望。

为了利用多价相互作用来增强基于 CRISPR 的转录激活的效力，研究筛选了12个 IDR 。 虽然所有这些 IDR 都以其诱导相分离的能力而闻名，但只有7种可以增强激活。以 dCas9-VP64-FUS 为例，研究证明了细胞，无论有无通过相分离形成的dCas9显微镜焦点，都显示出靶基因的有效转录激活。除了IDR还研究了几种MDs，这是另一类促进多价相互作用的分子，但尚未与转录调控相关。有趣的是，虽然MDs本身并不能增强dCas9-VP64的活性，但它们与dCas9-VP64- IDR 的融合会进一步增强转录激活。此外，通过改变gRNA结合位点的数量，并将dCas9-VP64与不同多价能力的 IDR 和MDs融合，研究发现最佳的顺反协同性(而不是最大的顺反协同性)对于强激活至关重要。最后，通过同时靶向启动子-增强子对，研究的增强激活系统显示出协同效应，这种协同效应严重依赖于 IDR ，并通过增强染色质相互作用进一步放大。 因此，研究开发了一个多功能平台，不仅用于有效的基因激活，而且用于研究潜在的分子机制。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-51694-y#Abs1