建议收藏 | 狂犬病疫苗进化史

狂犬病预防的历史始于公元前一世纪，有许多关于狂犬病及其治疗的神话和教条。直到十九世纪，对人类或动物的狂犬病还没有一致的诊断或治疗方法。技术，包括烧灼，建议用于治疗狂犬病伤口，在某些情况下，他们甚至切除或截肢。然而，所有这些信念从来没有解决人类和动物中令人震惊的死亡问题。公元25年，人们开始从科学的角度看待狂犬病。公元25年的塞尔苏斯促进了咬伤后伤口的早期治疗。1198年，摩西·迈蒙尼德描绘了被咬个体的长潜伏期。后来，依诺增爵八世·摩尔根尼于1769年确定了狂犬病病毒在神经组织中的偏好。1804年，Georg Gottfried Zink证明了患有狂犬病的动物的传染性唾液可能是传染源。1852年，法国药剂师阿波利奈尔·布沙尔达是第一个考虑接种疫苗预防狂犬病的科学家。1881年，法国兽医Pierre-Victor Galtier通过静脉注射狂犬病病毒，在绵羊中实现了第一次狂犬病免疫实验。

尽管疫苗开发的历史是由前巴斯德时代的疫苗学家开创的，但狂犬病疫苗开发的实际历史是在1885年由路易斯·巴斯德作为一种应急管理手段开始的，甚至在疾病的病原体被确定之前。最初，狂犬病的病因学不符合Koch的细菌理论，因为他们不能培养任何与该疾病有关的传染因子。甚至在19世纪晚期，狂犬病被认为是由一种寄生虫引起的，类似于孢子虫。直到1903年，他们都无法证明任何导致这种疾病的“滤过性病原体”。狂犬病病毒体的大小直到1936年才被确定，而对致病原的电子显微镜探索直到1962年才出现。尽管有这些限制，在1881年，巴斯德和他的团队与Chamberland，Roux和Thuillier可以跟踪狂犬病病毒在患有狂犬病的动物的中枢神经系统中的存在。

第一代疫苗的时代始于Louis Pasteur，他开发了第一种狂犬病疫苗，这种疫苗是从受感染的兔子脊髓中提取的，通过晒干使狂犬病病毒物理失活。通过多次传代和街毒(野生型)狂犬病病毒对实验动物的适应，巴斯德能够改变病毒在毒力和潜伏期方面的特性。通过将稳定量的街毒病毒制剂接种到兔硬脑膜上，重复传代超过50次，巴斯德观察到从接种到狂犬病扩散的潜伏期的一致性固定为7天。因此，他把这种病毒称为“固定”病毒。在对作为自然宿主的犬进行了几次实验后，1885年7月6日，巴斯德首次将他的实验性狂犬病疫苗注射给一个9岁的男孩约瑟夫·梅斯特，他有多次严重的狂犬病犬咬伤。咬后约2天，小男孩接受了13次注射风干的狂犬病病毒感染的兔脊髓悬液，其毒性逐渐增加，持续11天。巴斯德的这一战略性疫苗接种将梅斯特从狂犬病的死亡边缘拯救了出来。然而，巴斯德疫苗的主要缺点是它含有毒性越来越强的狂犬病病毒。此外，有人担心灭活的一致性，因为很少报告接种疫苗后出现狂犬病的病例。此外，无法生产足够的疫苗来满足需求是提供大规模疫苗生产的主要挑战。然而，巴斯德的方法随后被使用了50多年，之后在狂犬病疫苗制备中引入了重大的改进。

通过费米在1908年和森普尔在1911年进行的简单化学修饰，巴斯德疫苗得到了进一步的改进。较新的神经组织疫苗(NTVs)是由大卫·森普尔爵士在印度卡苏里的中央研究所(CRI)从成年绵羊(森普尔疫苗)中研制出来的。他们用化学试剂，如苯酚，使受感染的绵羊或山羊的大脑失去活性。苯酚的加入，虽然灭活了巴斯德疫苗，但仍然扭曲了蛋白质结构，破坏了狂犬病病毒的抗原性。此外，还报告了严重的副作用，如格林-巴利综合征(GBS)和传播传染性海绵状脑病的危险。虽然这种疫苗在世界许多地方广泛使用，但世卫组织最终在几乎所有国家暂停使用。

尽管费米疫苗和森普尔疫苗是成功的，但由于髓磷脂水平高，一些接种个体的致敏作用以及少数致命性脑炎病例的致敏作用增强，因此需要替代性的、反应原性较低的疫苗。在20世纪40年代，与疫苗接种相关的过敏性脑脊髓炎和中枢神经系统脱髓鞘疾病的临床研究受到了极大的关注。后来，鸡胚或鸭胚和新生啮齿动物脑等含胚卵的出现，作为生产狂犬病疫苗的介质，使得疫苗开发的旅程更加安全。临床证据显示，在胚胎和新生动物神经组织中缺乏导致疫苗副作用的物质。前苏联的研究人员利用老鼠开发了一种新生啮齿动物大脑疫苗。1964年，Fuenzalida和他的团队从乳鼠脑(乳鼠脑-SMB)中通过酚灭活并随后部分纯化开发了无髓磷脂灭活狂犬病疫苗。

新生动物组织中髓鞘质的缺乏使得SMB疫苗与森普尔疫苗相比反应原性较低。然而，研究表明，该疫苗并非完全不含髓磷脂，其他不良成分的存在会导致严重的不良反应。因此，与世卫组织的建议一致，全球的国家监管机构决定在该疫苗长期使用十年后停止使用该疫苗。

1931年，欧内斯特·w·古德帕斯彻(Ernest W. Goodpasture)利用含胚卵对各种人类病毒进行了改造，这为进一步研制狂犬病疫苗提供了一个新的平台。在使用活的动物之后，含胚胎的蛋被用于开发狂犬病疫苗。在1940年，狂犬病毒Flury株被用于1天大的小鸡。该毒株随后在鸡胚中建立。Flury low egg passage (LEP)疫苗由经历了40-50代卵并进一步从33%全胚胎悬浮液冻干的减毒活病毒组成。麻风疫苗被用于大规模的犬类疫苗接种，但仍有一些残余毒力，特别是在小猫、猫和牛中。随后，通过一系列近180次或更多次的卵传代生产了Flury高卵传代(HEP)疫苗。虽然这种疫苗在20世纪50年代和60年代进行了人体试验，但由于疫苗的效力不令人满意，最终被停止使用。在20世纪50年代末，鸭胚胎成为疫苗生产中鸡胚的替代品，他们开发了用于狂犬病的鸭胚胎疫苗(DEV )，该疫苗在10%的全胚胎悬浮液中含有狂犬病病毒，使用β-丙内酯灭活。这种疫苗在美国被广泛用于人类，直到20世纪80年代。由于不良反应和抗原性差，这些疫苗后来被停用。狂犬病病毒对胚胎的成功适应为替代脑组织疫苗带来了希望。尽管不同的战略方法可以略微提高这些疫苗的质量，但关于它们的安全性、有效性和免疫原性的问题并没有得到完全的认可。因此，这些疫苗在全球许多地区暂停使用，集中于用于繁殖狂犬病病毒的细胞基质的研究导致了细胞培养疫苗时代的到来。

用于病毒繁殖的细胞培养系统的建立导致了狂犬病疫苗开发的新范式，这导致了第二代细胞培养疫苗的产生。细胞培养系统是生产病毒疫苗的常用方法，因为它比神经组织疫苗和基于卵的系统有许多优点。它提供了一个确定的安全性和有效性，以及减少了交货时间和更高的过程灵活性。1930年，在鸡胚脑细胞的初级外植体中完成了狂犬病毒的培养，并且该病毒进一步维持了5个连续传代。后来，研究集中于固定RABV在小鼠胚胎脑组织中的繁殖。1942年，Plotz和Reagan在鸡胚细胞的初级外植体中首次成功地从患狂犬病病例的脑中直接体外分离和培养了街毒狂犬病病毒。后来，1958年提出了在非神经元组织中培养狂犬病病毒的概念，这导致了使用固定狂犬病病毒(来源于感染狂犬病的小鼠脑)和街毒狂犬病病毒(分离自患狂犬病的犬的唾液腺)从原代仓鼠肾细胞中首次组织培养狂犬病疫苗。Kissling能够通过15次细胞培养传代连续繁殖固定的病毒，并且还通过4次传代成功地维持了街毒病毒。在此之后，1960年，Fenje使用细胞培养物实现了狂犬病病毒株的首次适应，该细胞培养物可能用于疫苗生产，使用在小鼠脑中繁殖的街毒 Alabama Dufferin (SAD)株，并通过交替传代在原代仓鼠肾细胞培养物和小鼠脑中适应。

后来，在1963年，Kissling和Reese在原代仓鼠肾细胞中制备了第一种实验性细胞培养狂犬病疫苗，即原代仓鼠肾细胞疫苗(PHKCV )，所述原代仓鼠肾细胞接种有先前适应的攻击病毒标准(CVS)株的固定狂犬病病毒。1968年，使用固定毒株CL-60(街毒 Alabama Dufferin[SAD]狂犬病病毒的衍生物)开发的PHKCV在加拿大获得许可。后来，在1971年，使用前苏联的Vnukovo-32毒株生产了PHKCV。在Kissling之后，科学家们开始采用不同的细胞培养系统来繁殖各种狂犬病病毒株，以用于疫苗开发。在1964年，Abelseth使用在原代猪肾细胞中繁殖的狂犬病病毒SAD株开发了用于家畜的减毒狂犬病疫苗。后来，在1965年，近藤利用原代鸡胚细胞培养物的敏感性，繁殖了一种适应卵细胞胚的Flury-HEP狂犬病毒株，开发了一种用于人类的灭活狂犬病疫苗。在1969年，Wiktor使用从幼仓鼠肾细胞衍生的BHK-21细胞系生产纯化的浓缩狂犬病疫苗。利用巴斯德病毒(PV)的胎牛肾细胞狂犬病疫苗和利用Pitman- Moore毒株(PM)的犬肾细胞狂犬病疫苗分别于1974年和1978年研制成功。它们中的每一个都获得了在荷兰使用的许可。

通过使用二倍体细胞株生产疫苗的现代细胞培养技术，高质量狂犬病疫苗的生产逐渐变得可行。随后，固定的RABV在人类二倍体细胞株HDCS“WI 38”中生长，这是由Hayflick和Moorhead于1961年开发的53].后来在20世纪70年代中期，WI-38细胞系被转换为MRC-5细胞系，用于开发许可的人类二倍体细胞疫苗(HDCV) 。HDCV是第一种不含任何佐剂的纯化、浓缩和冻干狂犬病疫苗。此外，HDCV的副作用更少。因此，世卫组织推荐狂犬病HDCV作为金标准参考疫苗，但人类二倍体细胞疫苗的病毒产量较低，并且在许多发展中国家不太经济实惠。这使得开发与人二倍体细胞疫苗同样有效的替代疫苗成为必要，这导致了纯化鸭胚胎细胞疫苗和纯化鸡胚细胞疫苗的开发。

在1971年，使用先进的纯化方案改进的完全鸭胚胎来源的组织疫苗接种，促进了使用CVS株生产纯化的鸭胚胎细胞疫苗(PDE cv )。1985年，瑞士血清和疫苗研究所批准了利用Pitman-Moore毒株的PDECV疫苗。此外，PDECV在某些欧洲和亚洲国家注册；然而，它在美国没有被授权。这些疫苗被证明优于DEV，因为它们完全不含卵蛋白和髓鞘碱性蛋白，而卵蛋白和髓鞘碱性蛋白是过敏性脑脊髓炎的重要来源。后来，在1972年，使用Flury HEP病毒，开发了纯化的鸡胚细胞疫苗(PCECV)。后来，在Flury LEP病毒的帮助下，另一种PCECV被开发并灭活，用作疫苗免疫犬数年。第二个人用PCECV是通过在鸡胚成纤维细胞(CEF)中适应Flury LEP株而开发的，并于1984年在欧洲获得批准。在美国，使用LEP-c25病毒生产了另一种PCECV，并于1997年获得许可。目前，PCECV是最常用的人用狂犬病疫苗之一。由于具有相当的免疫原性和耐受性，纯化的鸭胚胎细胞疫苗(PDECVs)或纯化的鸡胚胎细胞疫苗(PCECVs)已成为世界许多地方预防人狂犬病的人二倍体细胞疫苗的有效替代选择。       

然而，原代培养系统对细胞分裂有固有的限制。二倍体细胞株，如WI-38、MRC-5和FRhL-2，具有大约50次连续传代的有限寿命，此后，细胞变得衰老。尽管它们具有繁殖能力，但适应疫苗生产的大规模商业培养在技术上具有挑战性。这导致了使用连续细胞系生产疫苗。1962年，非洲绿猴肾细胞产生了Vero细胞系。与原代培养细胞相比，产生更高的病毒滴度，细胞培养系统的简单放大，以及在疫苗中使用的长期历史而不引起任何安全问题，使得Vero细胞系在各种病毒的繁殖中具有吸引力。在1980年代早期，狂犬病病毒在Vero细胞中繁殖用于疫苗生产。Vero细胞支持多种狂犬病病毒的复制，包括HEP、CVS、Mokola病毒、Duvenhage蝙蝠病毒和Lagos蝙蝠病毒。Vero细胞的好处是大大降低了生产狂犬病疫苗的成本，并使大多数发展中国家能够获得狂犬病疫苗。进一步将纯化的Vero细胞衍生狂犬病疫苗(PVRV)引入临床实践对于预防狂犬病仍然至关重要。1985年，纯化的Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)在欧洲获得许可。此外，世卫组织提出用通过细胞培养开发的更有效、更安全的疫苗取代神经组织疫苗。目前，PVRV在全球范围内广泛使用。作为疫苗生产过程中的一个进步，一种增强的无血清PVRV-下一代(PVRV-NG)疫苗从灭活的兔瘟病毒PM株中生产出来。这种下一代疫苗的免疫原性和安全性使其成为狂犬病预防的新选择。

尽管多年来已经发明了许多抗狂犬病疫苗来保护人类和动物免受狂犬病的侵害，但是候选疫苗的安全性和免疫原性仍然是最重要的。然而，疫苗开发的基本概念，如减毒和灭活，始终是正在进行的狂犬病疫苗创新的支柱。狂犬病疫苗研究的持续努力主要集中于提高候选疫苗的免疫原性和安全性，这导致了改良或灭活疫苗的出现。

改良活疫苗通常是通过改变天然存在的病毒的致病性来生产的，因此它可以产生强大的免疫反应，而不会导致临床疾病。大多数科学家通过在不同细胞中连续传代来改造病毒，以确保未来疫苗的安全性，这导致了针对包括狂犬病在内的各种疾病的减毒活疫苗的开发。狂犬病毒的原始SAD (街毒 Alabama Dufferin)毒株是目前使用的所有减毒疫苗的来源，这些疫苗在细胞培养中经过多次传代后，都发生了不同程度的减毒。大多数改良活疫苗通过用克隆幼仓鼠肾细胞的连续体外选择或通过在小鼠体内的连续传代而减毒。

在一些亚洲国家，一种鸡胚来源的MLV疫苗Flury株已经被研制出来并用于动物。与此同时，MLV疫苗使用了用仓鼠肾细胞生产的街毒-Alabama-Dufferin (SAD)毒株供进一步使用。为了创造一种在质量上优于Flury-LEP疫苗接种的疫苗，1974年，加拿大引入了减毒活疫苗株Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA )，作为Flury低卵传代疫苗，该疫苗由于疫苗中的组织碎片而具有负面后果。最终，Flury低卵传代疫苗在20世纪70年代末被韩国兽医局用ERA毒株取代。通过肌内途径接种ERA减毒活疫苗的家畜(包括犬、羔羊、山羊和猫)没有表现出任何临床症状，并且没有从它们的唾液腺或脑中回收疫苗株，但是它仍然引发了强烈的免疫反应和升高的病毒中和抗体(VNA)滴度。不幸的是，近50%接受脑内注射疫苗的犬出现了明显的临床症状，如厌食、发热、严重震颤、轻瘫和瘫痪。由于它们的残余毒力，这仍然是改良活疫苗的主要缺点。此外，MLV对温度波动更为敏感，意外自行接种MLV狂犬病疫苗对接种者来说风险很大。尽管MLV的免疫原性更强，并且犬可以安全有效地接受改良的活狂犬病疫苗株(ERA、Flury和SAD)，但最终，世卫组织在2004年停止推荐注射用MLV狂犬病疫苗。

灭活疫苗的历史始于大约一个世纪前，当时在某些非洲和亚洲国家使用了针对狂犬病开发的灭活神经组织疫苗。大多数传统狂犬病疫苗使用与野生型病毒具有相同抗原特性的完全灭活病毒。已经证明，用完全灭活的病毒进行免疫，通过激活辅助性和细胞毒性T细胞，并防御致命的脑内狂犬病病毒攻击，导致病毒中和抗体的产生。

在全球范围内，已经使用各种狂犬病病毒毒株生产了灭活狂犬病疫苗，包括CVS 11、Pittman-Moore-NIL2、RC-HL(由西原毒株生产)和巴斯德病毒毒株。目前，批准用于人类的狂犬病疫苗是基于在细胞培养物或胚胎鸭或鸡蛋系统中繁殖的灭活纯化狂犬病病毒。通常使用β丙内酯(BPL)、紫外线、乙酰乙胺或二元乙烯亚胺(BEI)灭活狂犬病疫苗株。BPL是最常用的灭活剂；然而，它价格昂贵，并且在37℃下不稳定。由于苯酚和甲醛可能会扭曲抗原位点的结构，因此不再建议将其用于病毒灭活。相比之下，BEI处理起来不太危险，并且具有稳定性好、成本低和易于制备的优点。然而，较低的免疫原性、昂贵以及在暴露前尤其是暴露后免疫中需要多次接种方案是灭活疫苗的基本缺点[66].因此，为了增强免疫应答，抗原佐剂被包含在灭活疫苗中。这导致了佐剂疫苗的发展。

佐剂是通过增强炎性反应来增加或调节对疫苗的免疫反应的物质，所述炎性反应是抗原驱动的原始B和T细胞刺激所必需的。由于灭活疫苗、亚单位疫苗和合成疫苗的使用，佐剂一直备受关注，灭活疫苗、亚单位疫苗和合成疫苗基本上是弱免疫原性的，佐剂作为补充用于增强免疫原性，并由于其免疫扩增能力而产生更有效的疫苗。佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝和皂角苷，是常用的佐剂。然而，目前使用的大多数佐剂是铝盐。尽管明矾是第一个被批准用于人类的佐剂，但据称明矾延迟了抗体的早期产生，并且在诱导细胞免疫方面并不同样有效。某些制剂对少数抗原的不利副作用、毒性和有限的佐剂性是佐剂的主要缺点，这使得开发合成衍生物，如胞壁酰二肽、脂质体、QS21、单磷酰脂质、MF-59和免疫刺激复合物(ISCOMS)作为替代佐剂成为必要。近年来，许多研究集中于开发替代佐剂以提高灭活狂犬病病毒疫苗的免疫原性和有效性，并且开发了多种其他化合物，包括靛玉红根多糖、CpG寡脱氧核苷酸、单磷酰脂质A (MPLA)、β-葡聚糖，金黄色葡萄球菌来源的透明质酸(HA)和卡介苗纯化蛋白衍生物(PPD)。这些候选佐剂肯定是未来开发新型佐剂狂犬病疫苗的有前途的平台，具有增强的免疫增强潜力和降低的不良健康影响的风险。

修饰活疫苗的残余毒力所带来的风险以及灭活疫苗的低免疫原性和引发保护性免疫反应所需的大量抗原和重复剂量保证了对更安全和更经济的狂犬病疫苗的需求。目前，重组DNA技术和反向遗传学等技术的出现，使人们对狂犬病病毒基因组有了深入的了解，并促进了基因操作，这反过来为更有效和更安全的疫苗带来了更大的希望，降低了成本，提高了稳定性和免疫原性。这导致了针对重组狂犬病病毒株或个体重组狂犬病抗原糖蛋白(G蛋白)的下一代疫苗的时代，这有助于克服减毒活疫苗的缺点。

遗传修饰的病毒是通过生物技术方法对病毒基因组进行遗传修饰，通过定向插入、缺失、人工合成或改变核苷酸序列而产生的，并且仍然保留感染能力。大多数狂犬病疫苗包括以某种方式使病毒减毒、弱化或灭活，从而使其毒性特征变得无效。对病毒基因组的遗传学关注已经证实糖蛋白(G)与RABV致病性最相关，并且已经发现了与病毒致病性相关的某些氨基酸位点。因此，就在这些氨基酸中产生位点特异性突变或插入修饰的糖蛋白而言，对亲本狂犬病病毒株的进一步遗传操作将消除残余致病性，消除潜在的毒力回复，减少潜在的原始氨基酸回复突变，并增强所得突变体的安全性，这反过来将是产生高度减毒狂犬病疫苗的有希望的选择。

特别是，这些疫苗对于发展中国家甚至发达国家野生动物栖息地的流浪犬的大规模免疫接种是至关重要的，并且作为各种研究努力的结果，已经开发了许多突变疫苗株。开发了在RVG (G333E)的残基333处具有精氨酸至谷氨酸突变的遗传修饰的ERA疫苗株野生型(rERA)。通过对犬的肌肉注射和对小鼠的口服免疫，这种活的rERAG333E可诱导产生强而持久的RVNA，其强度高于ERA株野生型(rERA)。此外，使用反向遗传学，在rRABV的RVG基因的氨基酸位置333突变了完整的基因组，并且在BHK/T7–9细胞中拯救了辅助质粒，导致ERAG3G株的构建，该株在小鼠中进一步口服免疫后，显示出对致病性RABV的完全防御。另一种新毒株ERAGS是一种在RVG第194位和第333位具有位点特异性突变的rRAVB，在免疫接种的小鼠中发现其对高致病性RABV是非致病性的、极其安全且高度有效。一种新的和高度减毒的双糖蛋白狂犬病病毒构建体，SPBN GASGAS，通过在氨基酸位置194和333处的突变和一个额外的相同改变的糖蛋白基因从狂犬病毒株SAD L16产生。通过降低回复毒性的潜在风险和增强细胞凋亡，所得突变体具有改善的安全性。最近，SPBN gas已经作为口服接种的有效狂犬病疫苗候选物占据了特殊的位置，以减轻某些发展中国家(如泰国、海地、纳米比亚和摩洛哥)自由漫游的犬的狂犬病。

出于安全考虑和提高免疫原性，通过编辑狂犬病毒基因组以编码糖蛋白的两个或多个拷贝，或使用仅克隆和表达狂犬病毒糖蛋白(RAVG)的策略，产生了进一步的重组疫苗变体。编码两个拷贝的糖蛋白基因的重组狂犬病疫苗构建体在小鼠中提供了更好的保护，并在犬中提供了针对攻击病毒标准-11 (CVS-11)株的毒性攻击的保护。这些研究还揭示了含有两个拷贝的G基因的RABV增加了G基因的表达，这大大提高了疫苗的效力，增强了免疫原性，产生了更高水平的病毒中和抗体并降低了致病性。G基因表达的增加与细胞凋亡的增强相关，这有助于诱导与宿主免疫反应相关的基因的强烈上调，这在被减毒RABV株感染的神经元中观察到。因此，这些重组RABV株可能是未来有前途的灭活疫苗候选株。

来自致病病毒的遗传物质被用于核酸疫苗中，以产生针对传染性物质的保护性免疫反应。由核酸制成的疫苗具有成本效益高、安全高效的潜力。此外，由核酸疫苗引起的免疫反应仅集中于选定的病原体抗原。核酸疫苗可以是DNA(如质粒)或RNA(如信使RNA (mRNA))，并显示出治疗多种疾病的显著潜力。这是基于将DNA克隆到递送质粒中或通过直接接种信使RNA (mRNA)在宿主细胞中表达抗原。此外，宿主机制将有助于内源性蛋白质合成，这模拟了引发针对所表达抗原的细胞和体液反应的自然感染。

通常，足够水平的病毒中和抗体针对狂犬病病毒糖蛋白，这反过来与狂犬病保护相关。使用重组DNA技术可以容易地将糖蛋白基因克隆到合适的表达载体中，这有利于糖蛋白在体内的有效表达，并导致狂犬病DNA疫苗的生产。自1994年以来，DNA疫苗被认为是一种更经济有效的狂犬病预防方法，其可行性已在多种动物模型中得到证实，包括伴侣动物[84].巴斯德病毒(PV)、攻击病毒标准(CVS)、Evelyn Rokitnicki-Abelseth (ERA)或街毒病毒分离株的糖蛋白序列用于评估DNA狂犬病疫苗。RV糖蛋白在各种表达载体中表达，包括pSG5、pCIneo、pVR105、DNAVACC，并成功地在实验动物中产生特异性免疫反应。尽管该技术已被证明是有效的，但它的广泛使用，尤其是在狂犬病暴露后预防中的广泛使用，受到较慢和较弱的免疫反应的阻碍。然而，糖蛋白编码质粒与化学佐剂的共同给药或细胞因子基因的共同递送和创新的递送技术，包括DNA注射后的电穿孔和与传统灭活狂犬病疫苗的共同给药，在增强免疫应答方面是有效的，并增加了它们预防和管理狂犬病的潜力。此外，载体设计和递送系统的当前发展也为提高狂犬病DNA疫苗的有效性带来了希望。然而，与质粒DNA整合到宿主染色体、对质粒DNA载体的耐受性的形成、抗原和自身免疫相关的风险需要在它们被开发成广泛使用的疫苗之前得到关键解决。

RNA疫苗是最简单的核酸疫苗，是一种极具潜力的疫苗开发替代平台。RNA疫苗比DNA疫苗有许多优点。RNA疫苗直接在细胞质中翻译，消除了转运到细胞核中的需要，导致快速抗原表达，而没有可能与宿主基因组整合的风险。众所周知，RNA是一种强有力的佐剂，它通过模式识别受体，如Toll样受体或视黄酸诱导基因I样受体。信使RNA (mRNA)自我复制的能力导致目前两种主要类型的RNA疫苗的发展:传统的非扩增mRNA疫苗和来自RNA病毒载体的自我扩增mRNA疫苗(也称为复制子)，例如塞姆利基森林病毒(SFV )，其保持复制活性。研究表明，编码RABV G基因的传统的基于非扩增mRNA的狂犬病疫苗刺激有效的VNAs和抗原特异性CD4+和CD8+接种小鼠的t淋巴细胞并保护它们免于致死性脑内攻击感染。类似地，发现基于mRNA的狂犬病疫苗在具有有效VNA水平的家猪中具有免疫原性。一种基于自扩增mRNA的狂犬病疫苗，其重组SFV含有编码RABV G蛋白的RNA(SFV-RVGP )，该疫苗可引起功能性三聚体RABV G蛋白的高表达水平，诱发与商用狂犬病疫苗相当的抗体水平，并且在产生细胞免疫反应方面比蛋白疫苗更有效。然而，一个主要的挑战是RNA疫苗的不稳定性，这是由于RNase介导的降解或由于带负电荷的mRNA分子与带负电荷的细胞膜相互作用而导致的静电排斥，导致RNA递送后抗原的瞬时表达，这需要引起高度重视。

蛋白质疫苗通过使用肽或蛋白质作为抗原来刺激免疫系统。蛋白质抗原可以从引起传染性疾病的病原体中天然产生，可以是完整形式，也可以是衍生的裂解产物。蛋白质亚单位疫苗也可以在重组系统中作为异源蛋白质产生，包括重组细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，作为天然来源的替代物。RABV G蛋白是病毒致病性的主要决定因素，也是负责诱导针对狂犬病的保护性免疫的主要保护性抗原。因此，G蛋白(从感染细胞中纯化)的有效性已在各种系统中被确定，并被用作预防狂犬病的蛋白疫苗的形式。然而，发现这些方法并不有效。酵母衍生的蛋白质未能在小鼠中引发保护性免疫反应，这很可能是由于终产物折叠不良[95].显示在昆虫细胞中产生的杆状病毒来源的G蛋白是免疫原性的，但所需的大量纯化可能会使这种方法不经济。目前，使用转基因植物生产疫苗越来越重要。研究人员还利用植物，如番茄、玉米、哈密瓜和烟草来表达RABV G蛋白，以制造可食用疫苗。这种疫苗可以在摄入后在小鼠中产生可检测的VNA反应和对抗攻击的保护。尽管这些类型的疫苗有可能以低成本生产，但有几个明显的缺点，包括免疫原性、疫苗在水果中的稳定性、在胃中的降解以及肠道免疫反应。因此，尽管可食用疫苗是一个理想的选择，但在它们被认为可以替代狂犬病疫苗之前，还需要更多的研究。

除了蛋白疫苗，许多RABV G蛋白的抗原表位已被鉴定，模拟这些G蛋白表位的合成肽已被生产并用作疫苗。用包封狂犬病病毒G5抗原区的合成肽接种的动物产生具有强亲和力但低中和潜力的抗体。发现狂犬病病毒糖蛋白的肽模拟表位(RABVG位点III模拟表位(C-KRDSTW-C ))在小鼠中具有更强的免疫原性，并为未来的狂犬病疫苗提供了新概念。然而，由蛋白质或肽制成的疫苗具有中等的免疫原性；65kDa病毒糖蛋白被合成，形成三聚体，并在三个可能的位置之一被适度N-糖基化。狂犬病病毒糖蛋白必须正确折叠成其天然三聚体形式，以便产生能够中和病毒的抗体，但这对于蛋白质疫苗来说仍然是一个挑战。

通过将感兴趣的抗原克隆到异源病毒中开发了病毒载体疫苗，该异源病毒将作为载体分子在宿主细胞内转移感兴趣的外源基因，从而导致其随后的表达。第一个表达外源基因的病毒载体是在1972年由猿猴病毒40产生的；从那时起，不同的病毒，包括腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、水泡性口炎病毒和慢病毒，已经被遗传修饰以使其无致病性，并被改造成疫苗载体，其可以潜在地刺激免疫系统对抗由编码的转基因产生的蛋白质。病毒载体引发的抗原特异性细胞免疫反应和强而持久的抗体水平及其固有的佐剂性使它们成为狂犬病疫苗开发中更有效的候选物。

一些研究人员针对不同的病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白。RVG疫苗接种的重组腺相关病毒(AAVs)增强了单次肌肉接种的狂犬病毒中和抗体(RVNAs)的保护水平。几种腺病毒(Ads)已被广泛用作疫苗开发中的疫苗载体，因为它们产生强烈的体液和细胞免疫应答。特别是，对编码狂犬病病毒糖蛋白的猿猴Ad载体进行了狂犬病疫苗接种试验。一种基于黑猩猩腺载体狂犬病病毒糖蛋白克隆AdC68-rab。通过肌肉注射接种疫苗后四周，GP将小鼠的RVNA滴度提高到超过建议标准的水平。基于C组黑猩猩Ad载体的ChAd155-RG的单次肌内注射在小鼠中诱导了高RVNA滴度和更有效的细胞免疫，以及在兔中非常快速、持续、强健和持久的rvna，并且在猕猴中rvna的保护水平持续长达48周。这些作用相当于一剂、两剂或甚至三剂Rabipur疫苗诱导的作用。与其他Ad血清型相比，发现具有黑猩猩Ad血清型68 (AdC68)和人类Ad血清型5 (AdHu5)的ChAdOx2 RabG具有更高的免疫原性，并且仅通过单次IM剂量在体内引发高水平的RVNAs。通过肌肉内、鼻内和口服免疫在小鼠和犬中产生的由鸡2型腺病毒狂犬病病毒糖蛋白(CAV2-RVG)产生的保护性免疫应答是相当可观的。此外，其他病毒载体，包括副痘病毒Orf病毒(ORFV)、水泡性口炎病毒(VSV)，貉痘病毒(RCN) ，单循环黄病毒、新城疫病毒(NDV) 和牛疱疹病毒I型(BHV-1)表达狂犬病病毒糖蛋白，有效地诱导RVNAs，并保持为有效的疫苗候选物。尽管如此，病毒载体的一个常见障碍是宿主对某些载体的预先存在的免疫力，这可能会使疫苗的效力最小化。然而，这可以通过使用在宿主中具有低血清流行性的替代载体来避免。此外，病毒载体狂犬病疫苗的开发已经向前迈进了一步，成为口服狂犬病疫苗候选药物和基础工具，以减少全球野生动物物种中狂犬病病毒的死亡人数。

动物疫苗是通过减少动物传染病病原体来保护公众健康的有效方法。狂犬病疫苗开发的悠久历史已经为肠胃外疫苗接种策略提供了许多有效的疫苗。然而，通过肠胃外疫苗接种对野生动物或自由活动的家畜(如宠物犬)进行疫苗接种仍然是一个挑战。因此，对根除狂犬病的替代疫苗接种策略的需求导致了口服狂犬病疫苗(ORV)的发展。口服疫苗使用诱饵口服给药，所述诱饵设计有封装在可口诱饵材料中的疫苗悬浮液密封小袋，所述诱饵材料例如动物肠、鸡头、蛋和基于犬粮的材料，这取决于目标物种。食用时，咀嚼运动使小袋穿孔，将疫苗悬浮液释放到口中。在这里，疫苗主要被腭扁桃体吸收，在进入部位进行少量复制后，引发保护性免疫反应。目前，有两种商业许可的ORV可用于野生动物狂犬病免疫。它们是改良活疫苗(MLV)和基于载体的疫苗(VBV)。在改良活疫苗中，狂犬病病毒被改良以减弱其毒力，但仍具有触发免疫系统产生抗体的能力。在基于载体的疫苗中，编码抗原性糖蛋白的基因被插入到病毒载体中，其可以通过在免疫接种时表达插入的狂犬病病毒糖蛋白来诱导免疫应答。自1978年以来，口服狂犬病疫苗(ORV)已经成功地用于控制欧洲和美国野生动物狂犬病。

改良活狂犬病病毒口服疫苗的开发始于1935年，来源于街毒阿拉巴马达费林(SAD)狂犬病病毒株。这种亲代SAD毒株是从美国患狂犬病的犬的唾液腺中分离出来的。随后SAD株在非自然宿主中的连续传代，如小鼠、鸡胚和非神经细胞系，包括仓鼠肾和猪肾细胞，进一步热稳定，产生了高度减毒的SAD-Bern、Evelyn Rokitnicki Abelseth (ERA)和SAD-B19株。这些毒株构成了第一代ORV，它是欧洲控制野生动物狂犬病的基石，并已在全球广泛使用。此外，为了改善第一代ORV的安全性，使用单克隆抗体在狂犬病病毒SAD株中诱导选择突变，产生第二代ORV、SAD VA1、SAG1或SAG2株。1990年，通过影响糖蛋白333位氨基酸残基的两个连续突变，从狂犬病病毒的SAD-Bern株中分离出一种双无毒突变株SAG2株。由于其安全性和遗传稳定性，SAG2毒株被证明是SAG1的改良版本。尽管这些疫苗成功地降低了野生动物的狂犬病水平，但在大多数狂犬病流行的国家，仍然需要在大量自由活动的犬群中有效地控制狂犬病。这就需要一种更安全的候选疫苗，在大规模犬类疫苗接种活动中补充肠胃外疫苗，这一点仍然至关重要[23].因此，反向遗传学的现代技术促进了定点突变，并且针对狂犬病病毒基因组中选定位置的特定变化导致了第三代MLV的发展。目前，SPBN GAS和ERA G333是目前用于犬科动物的两种第三代疫苗。尽管两种疫苗株来自不同的亲本株，但它们在G蛋白的氨基酸残基333处仍有相似的突变。这些位点特异性缺失和插入进一步提高了现有MLV的安全性和免疫原性。然而，对MLVs的一个主要担忧是疫苗病毒发生随机突变的可能性，这可能会使它们回复到引起狂犬病的毒性形式。据报道，第一代MLVs的颅内接种在免疫抑制小鼠中引起狂犬病。此外，有报告显示，在欧洲免疫抑制的狐狸和非目标物种中，在接种第一代MLV疫苗后，出现了11例疫苗相关狂犬病病例，占分发的4800万诱饵剂量的1 %。相比之下，第二代和第三代疫苗没有这方面的现场病例报告。

在某些发展中国家，当使用SPBN气体时，在自由漫游的犬中产生免疫反应的现场试验的成功是可观的。使用在泰国供应的含有SPBN气体的口服诱饵对2444只犬进行注射疫苗接种，这些地方的大约65.6%的流浪犬进行了有效的口服免疫接种。通过在海地野外条件下对犬进行大规模接种，对犬口服狂犬病疫苗的免疫反应进行了评估，结果显示，78%的犬在食用诱饵后产生了免疫反应。通过对纳米比亚当地自由活动的犬接种疫苗后长达56天的血清转化免疫反应进行监测，高度减毒疫苗株SPBN GASGAS的免疫原性通过口服疫苗成功保护了约79%的犬。这些调查证实了疫苗株SPBN GASGAS的免疫原性和ORV在发展中国家减少犬传播狂犬病的能力。此外，通过实验证明了在印度果阿流浪犬中使用口服诱饵进行狂犬病疫苗接种的可行性，该研究支持了这样的观点，即ORV将是一种有望显著提高犬疫苗接种覆盖率的新方法。此外，我认为在印度使用ORVs作为肠胃外大规模犬类疫苗接种计划的补充是可行的，并且能够接触到该国自由漫游的犬类群体。

基于载体的疫苗的开发有助于克服与MLVs相关的风险。这些基于病毒载体的狂犬病疫苗更有希望用于兽医和人类。几项研究工作已经产生了有效的基于病毒载体的ORV。将表达狂犬病病毒糖蛋白的重组痘苗病毒作为口服狂犬病疫苗在诱饵中进行测试，并显示在几种野生动物中诱导保护性免疫。在疫苗开发中，多种腺病毒被广泛用作疫苗载体，因为它们能产生强烈的免疫反应。在控制北美野生动物狂犬病方面，基于表达狂犬病糖蛋白(ONRAB)的可复制人类5型腺病毒(AdHu5)的口服疫苗诱饵的开发令人鼓舞。与第二代复制型腺病毒载体相比，第一代复制缺陷型腺病毒载体的功效和安全性得到了提高。一些报道显示，发现在E1缺失的AdHu5载体中表达的狂犬病病毒糖蛋白在啮齿动物和犬科动物中更有前途。然而，在45–90%的人群中，针对AdHu5的可检测病毒中和抗体(VNAs)的预先存在的免疫被发现抑制了由AdHu5载体引起的免疫反应。为了克服这些问题，目前，稀有血清型的人腺病毒或非人类物种腺病毒，如黑猩猩和犬科动物，已被用于载体构建和疫苗开发。表达狂犬病病毒糖蛋白的基于重组黑猩猩腺病毒血清型68的疫苗(AdC68)的鼻内或口服给药途径在新生小鼠中诱发有效的VNAs。通过口服途径，这种疫苗在年轻、暴露前的个体中的效果令人鼓舞。此外，基于黑猩猩腺病毒载体的狂犬病疫苗显示可保护犬免受致命狂犬病病毒的攻击。研究记录了通过在小鼠和犬中口服免疫，用犬腺病毒2狂犬病病毒糖蛋白(CAV2-RVG)产生的保护性免疫应答。

目前，有两种商业许可的VBV可用于控制野生动物狂犬病。RABORAL V-RG，其使用重组痘苗病毒载体，和ONRAB，与重组人腺病毒载体。使用VBVs的主要问题之一是可能由载体病毒本身引起的感染。研究强调，在美国，暴露于重组痘苗病毒载体疫苗可能会导致人类严重的皮肤炎症以及孕妇和免疫功能低下者的并发症，但是还没有关于腺病毒载体的公开报道。此外，对针对载体的现有免疫的潜在干扰是载体疫苗的主要问题，因为它阻止了针对狂犬病的充分免疫反应的产生。然而，目前的病毒载体已被改造成能够逃避预先存在的免疫，并使其更像是一种潜在的递送系统。口服疫苗在有效控制野生动物狂犬病方面的成功故事及其在实验研究中引发免疫的潜力突出表明了口服疫苗作为一种替代性战略疫苗在发展中国家控制狂犬病方面作为非肠道疫苗补充的有效性。

不同疫苗开发的当前研究的细节以及不同疫苗的优点和缺点总结于表1和表2.

表1.狂犬病疫苗的研究现状

*未指定疫苗名称         

表2.当前狂犬病疫苗的优缺点

疫苗刺激免疫反应的能力也取决于疫苗的接种途径。皮内接种将抗原递送到表皮和真皮之间的空间。该空间在解剖学上是免疫刺激的有利位置，因为皮肤的真皮和表皮层是抗原呈递细胞的丰富来源，例如朗格汉斯细胞、真皮树突细胞和真皮巨噬细胞，已知它们参与疫苗诱导的免疫反应，并且皮肤被视为理想的疫苗接种目标。真皮的毛细血管和淋巴管的广泛网络也使得白细胞和树突细胞更容易从皮肤行进到次级淋巴器官。大多数狂犬病疫苗通过肌内(IM)途径施用增加量的抗原。因此，由于这些抗原的价格以及偶尔的稀缺性，它的使用在许多不发达国家受到限制。通过皮内(ID)途径施用的减少剂量(通常为抗原标准剂量的10%或20%)能够引发类似于通过IM途径施用的标准剂量所引起的免疫反应。

在美国，1986年首次批准了狂犬病疫苗ID法的暴露前免疫，随后开发了一种成本有效的多位点皮内(ID)免疫方法。世卫组织专家委员会于1991年建议皮内注射现代狂犬病疫苗用于暴露后预防。根据世卫组织的一项综述，用于暴露后预防(PEP)或PrEP的通过ID途径给药的细胞培养狂犬病疫苗(每肌内剂量的效力> 2.5 IU)具有与通过IM途径给药的相同疫苗相同或更高的功效。同样，通过各种方法在牛中接种的狂犬病暴露前预防性疫苗的有效性揭示了通过ID途径中和狂犬病病毒(RVNA)的可观水平的抗体。采用eRIG和皮内注射5天(0、3、7、14和28天)PEP方案治疗狂犬病伤口浸润的联合治疗方案可以挽救人类、牛和犬的生命，而皮内注射途径由于其节省剂量的效果而被证明更加经济。类似地，通过皮下注射、肌肉注射和静脉注射施用灭活细胞培养狂犬病疫苗被发现是安全且具有免疫原性的。这些临床试验为在因费用而无法获得PEP的地区推广ID给药狂犬病疫苗提供了信心，并且ID作为一种比肌内免疫节省成本和剂量的替代免疫策略应该得到鼓励。

RABV通常感染神经系统(NS)。然而，在感染的早期阶段，病毒粒子被“注射”到肌肉和皮肤中，在病毒进入神经系统之前，它可能会在周围引起免疫反应。一旦RABV进入NS，它不太可能引起初级适应性免疫反应，因为NS是一个免疫特权位置，因为它缺乏专业的抗原呈递细胞和淋巴组织。然而，在进入NS后，RABV在感染后引起早期先天免疫反应，其特征在于抗病毒、化学吸引和炎症反应，所有这些都涉及被感染的神经元。由于在NS中的免疫效力不足，RABV使用免疫亚策略来逃避宿主免疫反应，从而成功适应宿主系统，并且细胞介导的免疫(CMI)反应在阻止病毒入侵和抑制RABV在感染初期进入外周神经系统(PNS)中起着关键作用。然而，血脑屏障是CMI反应的一个重大障碍。此外，通过产生干扰素β在神经元细胞上表达HLA-G分子导致原始人类T细胞转化为调节性T细胞，抑制性细胞因子如白细胞介素10的产生导致细胞免疫抑制。此外，体液免疫系统是对抗狂犬病病毒的关键防御机制。中和抗体可以阻断病毒的传染性，并阻止病毒粘附到免疫个体的神经元细胞上。根据研究，当暴露于RABV时，未接种疫苗的动物不能产生最佳水平的中和抗体，这使得病毒能够到达神经系统，表现为疾病。