在研究和项目中，GSEA是很常见的一个图，一般长这样：
我想做基础研究的同学或多或少都见过吧，GSEA最早主要分析这样的基因集或者通路：当某个基因集里面的基因大部分变化都比较小，比如大部分倍数为1.1、1.2倍，由于变化倍数小于一般我们筛选差异基因的标准（倍数的绝对值>2且P值、P.adj<0.05），所以这些这些基因就不能被一般的标准筛选出来，但是呢，一条通路里面的这么多基因都发生改变，你总不能说这个通路不重要吧。
所以我们看到上面的图中曲线是富集在左上角的，说明左侧分组（比如疾病vs对照中左侧是疾病，右侧是对照；或者左侧是A基因高表达，右侧是A基因低表达）中细胞周期的基因集活性是高的。
那这样基因集有意义吗？当然是有的，可能大家看组学的数据不多，其实在很多疾病（特别是炎症、损伤等特征比较强的疾病）的组学数据中，升高倍数最明显的基因一般都是与免疫应答、细胞因子等有关的基因，反倒是很多人关注的调控基因（比如转录因子）升高倍数并不高（说个背景知识：转录因子活化的方式比较多样，并不一定需要高表达才体现出来，比如蛋白磷酸化这种常见的翻译后修饰、蛋白的入核障碍和异常核滞留等）；另外一个问题是在某些方向（比如神经生物学领域），mRNA的表达变化并不会呈现出很高的变化，这是很早之前GSEA开发者提到的一个痛点。
当然，现在大家做GSEA分析的应用场景一般有几个：
1. 当把某个基因A沉默或者过表达后做RNA-Seq，通过GSEA判断A基因沉默后对通路的影响，所以当看到左侧A基因过表达组（或者对照组）通路活性升高时，一般可以推测A基因高表达的时候通路活化，反之A低表达的时候通路被抑制；药物处理或者干预的逻辑也是这样；
2. 用公共数据分析A基因与通路的关系：大致分析思路是根据A的表达量把样本分为A high和A low两组，然后比较high vs low两组的通路活性，这样也能得到上面的这个图，一般情况下A基因高在左侧，A基因低在右侧，借此说明A基因高与通路活性有关。
好，关键的地方来了。
在1这种情况下，我们对A（或者药物）进行了沉默或者过表达（干预），通过观察下游通路的变化确定A或者药物对通路的影响，是存在因果关系的：就像往池塘里面扔了一块石头，通过波纹的变化推测石头的大小等信息；但是在2的情况下，我们并没有对A进行干预，只是分析A的高低（甚至不是表达量）两组下通路的活化情况，所以最多只能说A与通路活性相关，并不能说A调控这条通路（主要区别是相关性vs因果关系），所以理论上存在A调控通路、通路调控A、以及A与通路只是偶然相关这几种可能性。
之所以说这个问题，是因为有不少文章里面直接基于2这个情况下的GSEA图就下结论说A基因激活或者抑制通路活性，实际上是不合适的。
那如果要进一步确定A在通路上游、A在通路下游还是A与通路只是偶然先关，就要通过实验验证了：如果A干预后通路指标以及下游指标有变化，（一般）可以说明A影响通路；反之如果干预通路（抑制剂、激活剂）等，发现A改变，（一般）可以说明通路影响A，当然不排除A与通路互相影响以及A和通路不影响的情况。
最后，大家如果有类似的困惑或者问题可以留言给我，祝大家新年快乐！
