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克服递送挑战治疗胶质母细胞瘤

胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统癌症最致命的形式，其致命的部分原因是无法有效的克服治疗耐药性。GBM中midkine（MDK）的上调加速了化疗药物（如替莫唑胺（TMZ））引起的DNA损伤的修复。因此，精确下调MDK表达有望减轻治疗耐药性。尽管RNA干扰（RNAi）和CRISPR-Cas9（CRISPR（簇状规则间隔短回文重复序列）基因编辑技术是有吸引力的方法，但它们的实施是具有挑战性的。这是因为静脉注射短干扰RNA（siRNA）或CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物的活性形式涉及一个复杂的三步过程。即生物制剂必须（i）通常通过内吞作用进入靶细胞；（ii）从内溶酶体逃逸进入细胞质；以及（iii）从载体上释放出来。这其中，在步骤（ii）中，生物制剂的内溶酶体逃逸通常较低（约2%）。此外，颅内递送还需克服几个生理障碍，尤其是血脑屏障（BBB）。

聚合物锁定融合脂质体

在这项研究中，哈尔滨医科大学蔡金全、Yu Zhao、Chuanlu Jiang和Xiangqi Meng等人展示了一种聚合物锁定融合脂质体（Plofsome），它可以穿过血脑屏障（BBB）运输，并将短干扰RNA或CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物递送到GBM细胞的细胞质中。Plofsome是通过使用无痕活性氧（ROS）可切割接头将“锁”整合到融合脂质体中设计成的，这样只有在穿过血脑屏障并进入高ROS水平的GBM组织后才会发生融合。研究结果表明，Plofsomes对MDK的抑制显著降低了TMZ耐药性，并抑制了原位脑肿瘤模型中GBM的生长。更重要的是，Plofsome仅在肿瘤部位有效，而在正常组织中无效，这提高了RNAi和CRISPR-Cas9联合治疗的安全性。相关工作以“Polymer-locking fusogenic liposomes for glioblastoma-targeted siRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing”为题发表在Nature Nanotechnology。

【文章要点】

一、MDK促进TMZ耐药和GBM细胞的进展

作者首先对患者来源的组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。与其他细胞类型相比，GBM细胞中MDK的表达显著升高。在大量TCGA神经胶质瘤RNA-seq数据集中，世界卫生组织4级GBM的MDK表达高于世界卫生组织2级和世界卫生组织3级神经胶质瘤。通过MDK表达对GBM患者进行分层，发现MDK表达高的GBM患者的总体生存率较低，而MDK表达低的GBM的患者生存期较长。在患者来源的神经胶质瘤组织中，免疫组织化学（IHC）测定证实，MDK在世界卫生组织4级组织中的表达高于世界卫生组织2级和3级组织，这导致了更恶性的GBM生长（图1）。在重叠三个基因集（scRNA-seq的肿瘤标志物、TMZ抗性细胞和亲本GBM细胞之间的差异表达基因（DEGs）以及低级别星形细胞瘤（LGA）和GBM之间的DEGs）后，作者鉴定出31个基因与TMZ抗性和GBM恶性进展有关基因鉴定显示，其中MDK是与低存活率最显著相关的基因。

图1 MDK促进TMZ耐药和GBM细胞恶性进展

二、Plofsomes及其递送性能

融合脂质体递送的药物可绕过内溶酶体途径，从而防止被溶酶体降解。然而，融合脂质体在脑靶向药物递送方面存在严重缺陷。它们通过与脑内皮细胞融合穿过血脑屏障，这导致脂质体在进入大脑之前会被分解。为了解决这个问题并基于上述发现，作者在融合脂质体上集成了一个“锁”，这样只有在穿过血脑屏障并进入GBM组织后才会发生融合。为此，作者展示了一种聚合物锁定融合脂质体（Plofsomes），它可以穿过血脑屏障运输，并将siRNA和CRISPR-Cas9-RNP复合物递送到GBM细胞的细胞质中。Plofsome是通过使用无痕修饰方法将四臂聚乙二醇邻二酚（4-臂PEG-oDP）锚定在Angiopep-2（Ang）修饰的融合脂质体表面上来制备的。由于GBM组织中的ROS水平很高，因此选择了一种无痕活性氧（ROS）可切割的接头。Ang是低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP-1）的特异性配体，在BBB内皮细胞和GBM细胞中高度表达。作者选择融合脂质体作为核心结构，因为它们具有优异的细胞质递送性能。具体而言，作者首先制备了常规融合脂质体，然后将4-（羟甲基）苯基硼酸（HPBA）基团偶联到融合脂质体上，与4臂PEG-oDP混合后，HPBA和邻二酚基团之间会形成化学键以驱动4臂PEG-oDP涂覆在脂质体表面，达到非融合状态。最后，通过用Ang肽对这些脂质体进行功能化获得了Plofsome（图2）。

图2 Plofsomes的表征

三、靶向递送基因治疗及机制研究

Plofsome在血液循环和BBB交叉过程中都保持非融合状态。进入大脑后，由于受到肿瘤组织中过表达的ROS（过氧化氢（H₂O₂））的刺激，Plofsomes中的苯基硼部分会经历顺序的氧化和水解，随后暴露的酚羟基引起一系列自牺牲电子消除过程，这会导致4臂PEG-oDP的分离，并使Plofsome变得融合。与解锁时可以打开的保险箱类似，Plofsomes仅与靶细胞融合，并在高H₂O₂水平的环境中释放其货物。选择MDK作为治疗靶点，研究表明，Plofsomes有效地将siMDK或CRISPR-Cas9-RNP复合物递送到GBM细胞的细胞质中。因此，Plofsome制剂对MDK的抑制降低了TMZ耐药性，并抑制了原位脑肿瘤模型中GBM的生长（图3）。最后，作者还进行了一项分子水平的机制研究，结果表明，TMZ抗性的缓解可能与MDK与膜蛋白CD109之间相互作用的减弱有关。当细胞用TMZ处理时Plofsome@RNP，STAT3磷酸化（产生pSTAT3）减弱，γH2AX水平升高。因此，挽救MDK表达可提高pSTAT3表达并恢复γH2AX表达（图6k）。这些结果表明，MDK通过与GBM细胞膜上的CD109结合，促进了TMZ抗性，随后增加了STAT3的激活。

图3 Plofsomes实现siRNA递送和基因编辑示意图

【结论与展望】

总之，这项研究开发了Plofsome，可以穿过血脑屏障，将siRNA和CRISPR-Cas9-RNP复合物递送到GBM细胞的细胞质中。具体来说，作者使用无痕ROS可切割接头将4臂PEG-oDP作为“锁”整合到脑靶向融合脂质体中，以构建Plofsomes。Plofsome在血液循环和BBB交叉过程中都保持非融合状态。进入大脑后，Plofsome受到GBM组织中过表达的ROS的刺激，从而分离出4臂PEG-oDP并变得融合。这种设计确保了只有在进入GBM组织后才能进行靶向融合和货物释放。结果表明，Plofsomes有效地将siMDK和CRISPR-Cas9-RNP复合物递送到GBM细胞的细胞质中。在原位脑肿瘤模型中，有效的MDK抑制导致TMZ耐药性和GBM生长抑制显著降低。至关重要的是，Plofsomes仅在ROS水平较高的肿瘤部位有效，而在正常脑组织中无效，这增强了RNAi或CRISPR-Cas9联合治疗对TMZ耐药性的安全性。

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来源：BioMed科技
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