Plus推荐 | 男性生育力与可移动DNA的“互惠互利”

NEJM医学前沿/报道

《新英格兰医学杂志》2017年7月27日发表了一篇关于可移动DNA与人类疾病的综述[1]。近年来，我们对可移动DNA元件在多种人类疾病中的作用有了越来越丰富的认识，因此这篇综述的发表非常及时。

在该综述中，作者Kazazian和Moran涵盖了许多重要的主题，包括（1）人类基因组中可移动DNA的种类；（2）作为诱变剂的逆转座子；（3）逆转座的机制；（4）逆转座介导的基因组重排；（5）体细胞与癌症中的逆转座事件；（6）宿主抵御可移动子的机制。在这篇对该综述的评论中，我们主要讨论了发育期间可移动DNA的活性，特别是这类DNA与人类繁衍之间千丝万缕的联系。

说到可移动DNA，就不得不提LINE-1——一种在人类基因组中极为丰富的重复序列。部分LINE-1是逆转座子，即LINE1的DNA被复制成RNA，随后这些RNA会被LINE1编码的逆转录酶复制回DNA，插入基因组。根据逆转座过程的发生时间和细胞特性，LINE-1插入可被分为体细胞或生殖细胞系事件。

在癌症活检标本中发现的插入大多发生在体细胞中，而且对癌细胞特异[2]。一项对结肠癌患者进行的近期研究显示，体细胞插入一般起源于供体LINE-1元件。在正常情况下，这些元件被DNA甲基化介导的转录沉默牢牢地限制在原地；但在特殊情况下，它们可以逃脱这种限制而复制到新的插入位点[3]。

与体细胞事件相反，生殖细胞系中的插入可以遗传，并能在世代之间传递，引发各种遗传性疾病的风险[4]。正如这篇综述中讨论的那样，最著名的病例就是A型血友病，它是被确认的第一种由LINE-1插入导致的疾病，突变的基因是凝血因子VIII。

科学家们在生殖细胞系LINE-1插入的发生时间问题上仍然争吵不休。理论上，生殖细胞系插入可以发生在生殖细胞发育的任何阶段（图1）。在人和啮齿动物中，生殖细胞系起源于胚胎发育早期的一小群原始生殖细胞（primordial germ cells，PGC）。这些PGC会迁移到生殖嵴，增殖、分化成四倍体精母细胞或卵母细胞，并最终通过减数分裂，成熟为单倍体精子或卵细胞。

对于男性，生殖细胞系LINE-1插入可发生于PGC、精母细胞、精子或之间的任意阶段。然而，生殖细胞系插入也可能发生于PGC特化之前。例如，如果逆转座事件发生在随后分化成PGC的前体细胞中，就可能产生这种情形。在这种情况下，如果某些前体细胞的子细胞形成体细胞系，那么在某些体细胞中也可能存在相同的插入。

图1. LINE-1在生殖细胞系插入的时间。

原始生殖细胞（PGC）创始细胞簇出现于胚胎发育早期，迁移到生殖嵴，增殖、分化并最终成熟为精子细胞。根据当前的研究，图中用闪电符号标注出易发生LINE-1逆转座的时间点。

科学家对某个问题存在争议，往往是因为这个问题很难研究。对于LINE-1插入的争论也不例外。新的LINE-1内源性插入发生的频率相对较低，这就给在已有大量LINE-1存在的基因组背景下检测新的插入带来了一个重大挑战。

为了便于检测插入频率，早期研究利用了经过基因工程改造的LINE-1转基因模型，以帮助研究者定量鼠类发育过程中的逆转座频率[5-7]。令人惊讶的是，在使用天然LINE-1启动子调控LINE-1转基因的模型中，在早期胚胎中观察到了频繁的插入[7]。同时，在这类模型鼠类子代中未发现可遗传的插入[7]。这与使用组成型启动子（constitutive promoter）调控LINE-1转基因的小鼠模型形成了鲜明的对比[5,6]。这些结果表明，可能有一种机制保护原始生殖细胞及其前体不受逆转座的过度影响。尽管其可能性尚未被试验验证，但极有可能的是，此类转基因在这些细胞中被转录沉默了。

有关LINE-1逆转座发生时间的另一种观点来自于Faulkner团队的一项近期研究[8]。通过第二代测序，该团队发现了共计11例新的全长LINE-1插入。他们确认，内源性的逆转座能够发生在胚胎发生早期，雌性胚胎（5/11）中的发生频率似乎比雄性胚胎（1/11）高。6例早期胚胎插入中，有4例在生殖细胞系中也能找到。其他3例插入似乎发生在雄性胚胎的早期PGC中。一例插入被认定发生在亲代中任意一方的晚期生殖细胞系中。总之，Faulkner等人的研究提供了引人注目的证据，证明新的LINE-1插入可以发生在更大的发育时间范围内——从早期胚胎到早期PGC，再到晚期生殖细胞，且雄性和雌性均可发生。然而，受较小的样本数目所限，我们仍不能确定大多数逆转座事件发生在哪个发育时期。

为了保护基因组的完整性，生物体进化出了多重防护机制以限制逆转座活动。男性生殖细胞中最重要的两个保护神是DNA甲基化和与PIWI家族蛋白相互作用的RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）通路[9]。一方面，逆转座子的新甲基化需要DNMT3L （DNA methyltransferase 3-like）蛋白。Dnmt3l缺陷小鼠患有雄性特异性减数分裂阻滞和不育[10]。另一方面，piRNA是生殖细胞中大量表达的小型非编码RNA。在胚胎雄性生殖细胞中，两种PIWI蛋白（MILI和MIWI2）与逆转座子来源的piRNA相互作用，致使逆转座子发生转录沉默（通过将DNA甲基化和H3K9me3靶向至逆转座序列）和转录后沉默[9]。在小鼠敲除模型中，piRNA通路的突变体必然导致雄性不育，并伴有逆转座抑制解除和精子发生阻滞。正如综述中所述，我们需要进一步研究解除逆转座表达的抑制是否引起减数分裂灾难（meiotic catastrophe）或导致逆转座子数目的增加。然而，最近发表的两篇论文为这些问题提供了重要的见解[11,12]。

在一项研究中，我们将一种新型单拷贝LINE-1转基因导入了piRNA缺陷的基因背景（如，Mov10l1敲除）中[11]。与以前的转基因模型相比，这一新型LINE-1报告转基因的优点是它受内源性小鼠LINE-1启动子调控。由于Mov10l1缺陷的生殖细胞没有再次甲基化，因此我们证实，piRNA通路调控该启动子。

在这项研究中，我们也开发了一种高灵敏度的微滴式数字PCR（droplet digital PCR），用来对LINE-1转基因插入定量。使用这项方法，我们发现，直到出生后第14天，第一群雄性生殖细胞开始减数分裂成为精母细胞时，在Mov10l1敲除的小鼠睾丸中的逆转座活性才发生了改变。这时，插入数目比对照组野生型小鼠提高了70倍。这种增高的插入水平会保持到成年期。我们分选了成体睾丸中的细胞组分，确定逆转座增加特异性发生于精母细胞的细线期和偶线期（比野生型高144倍）[11]。因此，我们的研究确定，解除逆转座子表达的抑制的确会导致piRNA缺陷的生殖细胞中逆转座的增加。

在Mov10l1敲除小鼠的睾丸中，逆转座的急剧增加正好发生于生殖细胞死亡之前[11]。这一发现是否表明解除逆转座表达抑制导致了piRNA缺陷动物中的减数分裂灾难和雄性不育呢？迄今为止，对于这个问题仍然没有定论。但多方证据表明，减数分裂方面的表型不是插入形成突变的结果。首先，当我们给予小鼠可有效降低LINE-1逆转座的核苷逆转录抑制剂时，表型没有被拯救[11]。其次，我们使用本研究组的转基因模型推测了内源性逆转座的频率。估计结果，内源性插入的频率是每个细胞2.3次。我们的结论是，这一水平的插入形成的突变过低，无法导致精母细胞死亡[11]。第三，Bourc’his及其同事进行的独立研究尝试直接对来自内源性LINE-1的逆转座进行定量[12]。通常，由于基因组拷贝的数量过多，定量新发内源性LINE-1插入的方法灵敏度不足。虽然如此，与我们的结果一致，这些作者没有在Dnmt3l-缺陷的生殖细胞中发现大量逆转座活性[12]。

那么，解除逆转座抑制是如何在减数分裂表型和雄性不育中发挥作用呢？Bourc’his及其同事提供了一些有趣的证据，支持了LINE-1激活可能在染色质水平发挥作用12。与野生型对照相比，Dnmt3l缺陷的生殖细胞的染色质图谱发生了改变：逆转座子序列上的抑制性H3K9me2修饰缺失及激活性H3K4me3修饰增加。这些生殖细胞染色质图谱上的改变与在逆转座子序列中形成减数分裂双链断裂有关。通常，在减数分裂重组位点处没有逆转座子。这种异常分布可能是Dnmt3l缺陷的精母细胞中染色体联合失败及后续减数分裂过程中断的原因[12]。

对LINE-1和精子发育关系的大胆猜测

毫无疑问的是，要进一步定义逆转座子在减数分裂过程中的作用，科学家还需要进行更多研究。例如，LINE-1的ORF2的蛋白具有核酸内切酶活性剂已知的细胞毒性[9]，但我们从未探索过高表达ORF2蛋白如何影响生殖细胞发育。另一方面，我们的近期研究也表明，可移动DNA与男性生育力之间有着互相依存、互惠互利的关系。简言之，逆转座过多可对生殖细胞产生不利影响，导致不育。反之，为了繁殖下一代，逆转座必须是适度的，且宿主要具备生育力。

基于我们的结果，我们预测，许多生殖细胞系插入起源于逆转座子调控水平折中、但仍有生育能力或生育力较低的个体[11]。这些个体可能以有隐睾、少精或原位睾丸癌病史的患者呈现，而这些患者往往与基因变异体或piRNA通路基因的表达降低相关。若这些预测得到证实，那么我们对LINE-1逆转座在发育中的发生时间，以及LINE-1介导的基因变异的来源和影响方面的知识将会显著改进。在雄性生殖细胞发育的晚期阶段，在精母细胞和精细胞中新的插入可能不会对这些生殖细胞本身的状况即时产生影响。然而，若传播到子代，这样的插入是有害的，会造成遗传性疾病。因此，生殖细胞系中的新逆转座事件可能是人类群体中存在的罕见有害基因变异体的重要来源。

参考文献