基于网络药理学探讨黄芪治疗代谢相关脂肪性肝病作用机制

1 方法

1.1 黄芪潜在活性成分及其作用靶点

在中药系统药理学分析平台（ TCMSP ， http ： //lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php ）中检索黄芪潜在药效成分，依照口服生物利用度（ OB ） ≥ 30% 、类药性（ DL ） ≥ 0.18 的标准进行筛选。并使用 TCMSP 数据库检索上一步得到的活性成分的作用靶点，将靶点通过 UniProt 数据库（ https ： //www.uniprot.org ）映射为标准基因名称，即黄芪活性成分与作用靶点。

1.2 黄芪治疗 MAFLD 作用靶点

在 GeneCards 数据库（ https ： //www.genecards.org ）中检索得到 MAFLD 相关靶基因。再使用比较毒物基因组学（ ComparativeToxicogenomics Database ， CTD ）数据库（ http ： //ctdbase.org ）的检索功能，获取与 MAFLD 相关基因，筛选经过实验验证的基因作为 MAFLD 相关靶点。将 2 个数据库获取的 MAFLD 相关基因合并删除重复项，得到 MAFLD 相关靶基因。再将 MAFLD 靶基因与黄芪活性成分作用靶点基因映射筛选，取交集，获得黄芪治疗 MAFLD 的潜在作用靶点。

1.3 靶点互作网络的构建

1.3.1 构建黄芪成分靶点网络 使用 Cytoscape 3.8.0 软件构建黄芪治疗 MAFLD 的黄芪 - 活性成分 - 作用靶点网络。在该网络中，节点（ Node ）代表黄芪活性成分及其作用于 MAFLD 的靶蛋白，边（ Edge ）代表活性成分 - 靶蛋白的相互作用。采用 Cytoscape 3.8.0 软件中的 “Analyze Network” 功能，对网络的拓扑参数进行计算，网络图中节点的节点连接度（ Degree ）越大，表示该节点在网络中的作用越关键，分析得出黄芪治疗 MAFLD 的重要活性成分。

1.3.2 蛋白质相互作用网络与重要靶点 STRING 数据库（ https ： //string-db.org ）是一种包含已知和数据预测的蛋白质 - 蛋白质相互作用（ Protein–protein interaction ， PPI ）的数据库，在 STRING 平台中将得到的黄芪治疗 MAFLD 的潜在靶点导入，设定种类为 “ 智人（ Homo spaiens ） ” ，置信度设置为 “0.4” 进行筛选，其余参数保持默认，获取目标基因的蛋白质相互作用信息的 tsv 格式文件，并通过 Cytoscape 软件构建 PPI 网络。运用 Cytoscape 软件的 MCODE 和 STRING 应用程序对 PPI 网络进行渲染和重要的基因模块聚类分析，执行 MCODE 和 STRING 应用程序中的所有默认参数，得到 PPI 网络中密集连接的网络组件（ Module ）， Module 内包含靶点即为黄芪治疗 MAFLD 的重要作用靶点。

1.4 基因本体分析和 KEGG 通路注释及富集分析

基因本体分析（ Gene Ontology ， GO ）是注释基因产物及其功能特征的通用方法，其中 GO 分析依据功能的不同，可区分为生物过程（ biological process ， BP ）、细胞成分（ cellularcomponent ， CC ）、分子功能（ molecular function ， MF ）。将交集靶点导入 Metascape 数据库（ https ： //metascape.org ），物种类型选择为 “Homo sapiens” ，再选择 “Custom Analysis” ，使用默认设定值作为筛选条件，进行 GO 分析和京都基因组百科全书（ Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes ， KEGG ）通路注释及富集分析，用于基因注解，并对结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 黄芪潜在活性成分

使用 TCMSP 数据库获取黄芪潜在活性成分，根据口服 OB ≥ 30% 、 DL ≥ 0.18 的条件，共筛选出候选活性成分 20 个，如表 1 所示。

通 过 TCMSP 数据库共检索出黄芪活性成分靶点 208 个，使用 GeneCards 数据库、 CTD 数据库检索得到 MAFLD 靶点 1 010 个，将两者取交集映射，得到 91 个靶点，即为黄芪治疗 MAFLD 的潜在靶基因，见表 2 。

2.3 网络图分析

2.3.1 成分靶点网络 以 91 个靶基因作为黄芪治疗 MAFLD 的作用靶点，建立黄芪治疗 MAFLD 的活性成分 - 靶点基因网络图，共有 105 个节点、 202 条边。节点表示黄芪活性成分及靶点，边代表了黄芪活性成分与靶点之间的相互作用， 20 个成分中有 14 个活性成分作用于 91 个 MAFLD 靶点，如图 1 所示。

经 Cytoscape 软件网络拓扑参数计算，黄芪治疗 MAFLD 的活性成分 - 靶点基因网络平均 Degree 值为 3.85 ，在 14 种活性成分中槲皮素、山柰酚、芒柄花素等 10 种活性成分的 Degree 大于均值，和多个靶点基因具有相互作用，可能是黄芪治疗 MAFLD 的重要潜在药效成分，黄芪各活性成分的拓扑参数见表 3 。

2.4 GO 富集分析和 KEGG 富集分析

利用 Metascape 网站对黄芪治疗 MAFLD 的 27 个重要靶点进行 GO 富集分析和 KEGG 途径富集分析，对富集结果按照 P 值排序， Count 值表示富集在该通路的基因数量。结果见图 3 ～ 5 。 GO 生物过程富集（图 3 ）主要涉及细胞因子介导的信号通路、细胞分化的负调控、对营养水平的反应、对氧气水平的反应、上皮细胞增殖的调节、活性氧代谢过程、对脂多糖的反应、调节平滑肌细胞增殖等生物过程。 GO 分子功能分析（图 4 ）中排名前 5 的功能涉及细胞因子受体结合、蛋白酶结合、组蛋白乙酰转移酶结合、血红素结合和趋化因子受体结合。 GO 细胞组分分析（图 5 ）中排名前 5 细胞组分是膜筏、细胞外基质、细胞质核周区域、 RNA 聚合酶 II 转录因子复合物、膜面和核膜。 KEGG 通路分析显示，在黄芪治疗 MAFLD 所涉及的通路中相关性排名前 15 名的通路涉及癌症相关通路、糖尿病并发症 AGE-RAGE 信号通路、白细胞介素 -17 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、利什曼病、类风湿关节炎、 HIF-1α 信号通路等通路，详见表 4 。

3 讨论

MAFLD 的发病机制尚不清楚，目前主要认为与瘦素抵抗、胰岛素抵抗、氧化应激、内质网应激、肠道菌群失调、自噬和 MicroRNA 作用、脂质代谢紊乱、炎症浸润、肥胖、 2 型糖尿病等 ^{［ 12-13 ］} 等多种潜在途径及损伤之间的相互作用有关。林敏华等 ^{［ 14 ］} 研究发现中药及有效成分治疗 MAFLD 的机制大多是通过改善血脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、抗炎、抗过氧化的作用，从而阻断肝细胞脂肪化和炎症浸润。

3.1 黄芪活性成分治疗 MAFLD 的靶点及作用机制

结合黄芪活性成分 - 靶点网络分析发现，槲皮素、山柰酚等 14 个成分是黄芪的潜在活性成分，能够与 91 个靶点相互作用，主要通过调节脂质代谢异常来降低肝细胞脂质累积来防治 MAFLD 。 Wei 等 ^{［ 15 ］} 发现槲皮素、山柰酚、异鼠李素等黄酮类成分能够抑制长链脂肪酸 β- 氧化过程中的脂质积累。研究发现槲皮素、山柰酚能够通过控制血清总胆固醇（ total cholesterol ， TC ），低密度脂蛋白胆固醇（ low-densitylipoprotein-cholesterol ， LDL-C ）和三酰甘油（ triacylglycerol ， TG ）的水平，减少了肝脏中脂肪的储存来防治 MAFLD ^{［ 16 ］} 。叶酸可减轻 HFD 诱导的糖脂代谢紊乱及脂质蓄积，对 MAFLD 有保护作用 ^{［ 17 ］} 。 Ganbold 等 ^{［ 18 ］} 研究发现异鼠李素能够通过抑制 NASH 小鼠新生脂肪形成途径来减少肝内脂质累积和血清 TG 含量，减轻 NASH 造成的肝损伤。研究发现槲皮素可通过提高自噬溶酶体降解能力，影响清道夫受体（ scavenger receptor ， SR ）介导的低密度脂蛋白（ oxidizedlow-density lipoprotein ， oX-LDL ）摄取能力来减轻 HFD 引起的肝损害，并降低血清胆固醇和 oX-LDL 含量 ^{［ 19 ］} 。 Panchal 等 ^{［ 20 ］} 发现槲皮素可减轻大多数代谢综合征的症状。槲皮素可能通过介导肌醇依赖酶 1α （ inositol-requiringenzyme1α ， IRE1α ） /X 盒结合蛋白 1 （ X-box binding protein 1 ， XBP1 ）信号通路途径促进极低密度脂蛋白（ very low‐density lipoproteins ， VLDL ）组装和吞噬脂肪来改善 HFD 诱导的 MAFLD 。研究发现，槲皮素可以激活胆汁酸受体法尼醇 X 受体 1 （ Farnesoid X receptor1 ） / 武田 G 蛋白偶联受体 5 （ Takeda G‐protein‐coupled receptor 5 ）信号通路，减弱炎症反应，调节脂质代谢从而治疗 MAFLD ^{［ 21 ］} 。研究表明，槲皮素可以通过介导同源性磷酸酶张力蛋白诱导的激酶 1 （ phosphataseand tensin homologue （ PTEN ） -inducedputative kinase 1 ， PINK1 ） /Parkin 线粒体自噬信号通路减轻肝脂肪变性 ^{［ 22 ］} 。 Liu 等 ^{［ 23 ］} 发现，叶酸通过抑制胰岛素或胰岛素样生长因子 -1 （ insulin-like growth factor 1 ， IGF-1 ）信号介导的磷脂酰肌醇 3- 激酶（ phosphatidylinositol‐3‐kinase ， PI3K ） / 蛋白激酶 B （ protein kinase B ， Akt ） / 固醇调节元件结合蛋白（ sterolregulatory element binding transcription proteins ， SREBPs ）信号通路抑制脂肪形成。 Xin 等 ^{［ 24 ］} 发现叶酸通过依赖沉默信息调节因子 1 （ Silentinformation regulator 1 ， SIRT1 ）上调过氧化物酶体增殖物激活受体 α （ peroxisomeproliferator-activated receptor α ， PPARα ）水平来改善肝脂质代谢，并恢复肝一碳代谢和肠道菌群多样性，从而治疗 HFD 诱导的 NASH 。

黄芪对 MAFLD 的防治作用可以通过抗炎和减轻氧化应激实现。研究结果表明，槲皮素能通过调节脂肪酸相关代谢产物、炎症相关代谢产物、氧化应激相关代谢产物和其他差异代谢产物，减少