摘要
近年来，基因治疗一直在取得突破，针对多种治疗领域中的特定细胞群。然而，大多数最近的临床研究仍然使用传统的病毒载体系统，这在商业规模上具有挑战性且成本高昂。非病毒载体已成为基因传递中一个快速发展的研究课题，如聚合物、脂质、无机颗粒以及不同类型的组合。虽然非病毒载体在细胞毒性、免疫原性和突变性方面较低，吸引越来越多的研究人员探索这一有前景的传递系统，但它们并不具备理想的特性，面临着包括基因转移效率、特异性、基因表达持续时间和安全性等关键挑战。本综述涵盖了非病毒载体研究和配方方面的最新进展，挑战以及未来展望。
二零二零年标志着基因治疗领域的又一个里程碑。第一个经过富集白细胞的基于细胞的基因治疗产品Tecartus于七月获得FDA批准（1）。从1990年第一个成功的基因治疗临床试验的动力到1999年宾夕法尼亚大学发生的导致技术降温的悲剧性死亡事件，基因治疗已经经历了漫长的道路，在2017年以一年三个FDA批准重新崛起。目前，美国市场上共有十种基因治疗产品，并且在clinicaltrials.gov上有超过100个临床试验正在招募患者。过去30年的基因治疗动荡局面已经提供了许多宝贵的经验教训机会，并为最近重新引起的对基因传递系统能够解决一些最具破坏性的疾病的能力的兴奋情绪奠定了坚实的基础。尽管近期有少数临床研究应用了非病毒载体，但大多数最近的临床研究仍然使用传统的病毒载体系统，在商业规模上具有挑战性。众所周知，载体是将基因材料传递到其目标位置的载体。它在产品的功效和安全性方面起着至关重要的作用。使用病毒载体在历史上一直存在争议。尽管病毒载体不被认为对患者造成任何伤害，但其潜在的引发免疫反应和转基因错位风险等小潜力导致许多领域内的人士继续寻求非病毒传递系统。近年来，经常研究的非病毒载体包括聚合物、脂质、无机颗粒或不同类型的组合（见图1）。与病毒载体相比，非病毒载体在细胞毒性、免疫原性和突变性方面较低，吸引了更多的研究人员探索这一有前景的传递系统，并推动基因治疗领域的发展。然而，非病毒载体并不具备理想的特性，面临着关键的挑战，如基因转移效率、特异性、基因表达持续时间和安全性等。非病毒载体已成为基因传递中一个快速发展的研究课题。本综述涵盖了非病毒载体研究和配方方面的最新进展。同时讨论了挑战和未来展望。基因治疗包括将遗传物质传递到细胞中，转染和调节基因表达。阳离子聚合物一直是一种重要的非病毒基因治疗载体类型，多年来由于其多功能化学结构和潜在的高载荷能力而吸引了研究人员。它们可以中和带负电荷的遗传物质形成复合物（聚合物复合物），并将有效载荷运送到靶向细胞中。聚乙烯亚胺（PEI）是1995年合成的第一种多阳离子聚合物，用于基因治疗，其分为线性和支链形式。它在聚合物链的主链上具有独特排列的胺基团，仅在生理pH范围内部分质子化。然而，在内体器官的更酸性区域，额外的胺基团被质子化。带电PEI的存在产生渗透效应（“质子海绵效应”），诱导内体小泡破裂，增强了转染效率。PEI的高缓冲容量也有利于基因有效载荷的内体逃逸。如今，PEI仍然是衡量非病毒载体转染效率的黄金标准。尽管被认为是高转染效率的非病毒载体，但PEI仍可能存在特异性和转染不足的问题。此外，它是一种不可生物降解的聚合物，在细胞周围积聚并引发细胞毒性。在过去的几年中，科学家在了解这些限制背后的机制方面取得了重大进展。PEI在细胞内传递过程中逃脱晚期内体小泡的能力，包括其在渗透压应激下与内体脂质的相互作用，由Clark等人使用来自中性和负性脂质混合物二棕榈酰磷酰胆碱（DPPC）和双（单酰基甘油）磷酸酯（BMP）的单分子层和小泡模型进行了研究。结果证实了PEI对DPPC/BMP膜的吸附，这是促进聚合物复合物内体逃逸的重要因素。该模型为研究非病毒载体对膜的稳定性和渗透性的后续影响提供了一种新工具。除了PEI之外，胺端PAMAM是另一种阳离子树状聚合物。事实上，PAMAM是生物应用中最常用的树状载体之一，也是首个用于基因传递的树状载体。这些常见的树状聚合物的主要缺点是它们的毒性，主要与表面胺基团的化学性质有关。此外，聚甲基丙烯酸酯和聚甲基丙烯酰胺是两种重要的合成乙烯基阳离子聚合物的大型变种，具有模拟PEI的pH敏感性、质子海绵理论和缓冲性能的能力。在过去的20年里，它们不断地进行改进，试图提高基因传递效率并降低毒性。尽管聚甲基丙烯酸酯的细胞毒性比PEI低，但由于其与膜的相互作用能力较低，目前其在基因治疗中的应用受到限制。聚（乙烯咪唑）（PVI）是一种水溶性聚合物，由聚（1-乙烯咪唑）和聚（4-乙烯咪唑）合成。其咪唑基在酸性pH下质子化，并改变PVI链的构象。PVI具有生物相容性、无毒性和通过激活质子海绵机制逃逸内体的能力等额外性质，使其成为新兴的非病毒载体。最近，已对具有不同链长的烷基化聚（1-乙烯咪唑）进行了DNA络合和转染的研究。其中，丁基化PVI在HepG2肝癌细胞中被发现是最有效的。此外，还发现了一种叶酸-共轭的含胺聚（1-乙烯咪唑），有效地形成复合物与DNA并转染癌细胞。
可生物降解聚合物
鉴于基因治疗通常需要重复给药，并且更倾向于具有较低的细胞毒性，可生物降解的聚合物载体，无论是合成的还是天然的，都比不可生物降解的聚合物具有明显优势。合成聚合物具有优良的化学结构多样性和批次一致性，但可能缺乏与细胞的充分相互作用。相反，天然聚合物具有较高的生物相容性，但由于来源差异，可能存在批次间变异问题。因此，为了确保产品质量，需要在天然聚合物的关键属性上采取控制策略。赋形剂公司有时会使用混合来满足赋形剂规格要求。此外，使用适当的测试和规格来确保一致的质量和可靠的性能。例如，凝胶渗透/尺寸排除色谱（GPC/SEC）可以用来测量聚合物的特性。要控制、减少或最小化赋形剂变异对天然赋形剂（包括聚合物）可能产生的负面影响，需要制药公司、赋形剂供应商、美国药典委员会（USP）、监管机构和国际药品赋形剂理事会（IPEC）的协作努力。
壳聚糖（CS）是一种线性多糖，也是最常见的天然碳水化合物聚合物之一。它具有高度可生物降解、生物相容性和无毒性。其表观pKa为6.5，在酸性条件下溶解，在这种条件下，大多数氨基团被质子化形成与遗传物质的复合物。研究发现，具有较高聚合度（>50）的壳聚糖能够显著促使细胞间紧密连接的开放。壳聚糖载体的表面也可以修改或装饰配体，以增强细胞进入和特异性。这些特性使壳聚糖成为一种吸引人的非病毒载体用于基因治疗。近年来，壳聚糖包被的纳米粒子被积极研究作为脑癌基因治疗的载体，其中通过受体介导的内吞作用，人类血脑屏障脑微血管内皮细胞（hCMECs）表现出增强的粒子摄取。聚（β-氨基酯）（PBAEs）是一类发展中的非病毒载体，在过去20年里取得了显著进展。该类别最初于2000年发展为线性PBAEs，但在2016年，这一类别的发展转向了支链PBAEs。这些两性聚合物在挑战性条件下表现出强大的转染能力以及有效的内体逃逸性质。然而，由于形成了自组装的核酸纳米粒子，它们的应用受到限制。因此，它们不足以封装各种表面电荷的蛋白质。2019年，Green等人合成了一种新的含阳离子和阴离子电荷的超支化PBAE。结构变化改变了聚合物末端基团的疏水性，影响了蛋白质络合能力，以及纳米粒子的内化和内体逃逸。同年，Liu等人合成了含有可生物降解二硫化单元的高支化PBAE，其主链含有胍基基团。这些聚合物将迷你环DNA传递到多能性脂肪来源干细胞和星形胶质细胞中，实现了高转染效率。传统上，聚乳酸（PLA）是一种被广泛应用于药物递送的合成可生物降解聚合物。其羧酸在体内水解成乳酸，并迅速转化为葡萄糖排出体外，没有不良影响。2013年，Jones等人合成了一种带有三级胺的阳离子聚乳酸，使其适用于基因治疗。如今，通过持续的结构修改，PLA在靶向递送方面仍受到持续关注。基于聚合物的递送系统的全部潜力尚未被充分实现。在2020年，氨基糖苷类，一类天然存在和半合成抗生素，已被研究作为新的阳离子聚合物载体，以促进基因进入细胞。脂质长期以来一直被用于基因传递。大多数脂质由带正电的头基组成，通过静电相互作用与核酸的阴离子磷酸基团结合形成脂质复合物。由于自组装的脂质尾结构，脂质复合物通常以脂质体、固体脂质纳米粒子或脂质乳液的形式存在。与其他载体材料相比，脂质具有生物降解性、毒性较低，并且可以包含亲水性和疏水性物质。第一个获得FDA批准的小干扰核糖核酸（siRNA）治疗药物（Onpattro）采用了基于脂质的载体。另一种治疗高脂血症的有前途的基于脂质的siRNA疗法（inclisiran）于2020年12月在欧盟获得批准。三期临床试验显示，inclisiran通过每6个月皮下给药将低密度脂蛋白胆固醇水平降低了50%。传统脂质分子上具有一个头基组，可以永久或临时带电。常见的头基组包括铵、咪唑、吡啶、赖氨酸或精氨酸等。与此同时，疏水尾部可以是两条饱和或不饱和的碳氢链或类固醇。疏碳链脂质传递核酸的能力已经得到广泛探索，特别是带有铵作为头基组的脂质。常见的例子包括单价脂质，如N-（1-（2,3-二油基氧基）丙基）-N，N，N-三甲基铵（DOTMA）、2,3-双[[（Z）-辛二烯酰]氧基]丙基-三甲基氮（DOTAP）、2,3-二（四十四烷氧基）丙基-（2-羟乙基）-二甲基氮（DMRIE）、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC），或多价脂质，如2,5-双（3-氨丙基氨基）-N-[2-[二（十七烷基）氨基]-2-氧乙基]戊二酰胺（DOGS）。尽管这些脂质由于其正电荷而保持为主要的基因载体，但它们相对具有毒性，并在体内行为不理想，例如半衰期短。因此，对表面修饰的可离子化脂质，例如1,2-二油酰基-3-（二甲基氨基）丙烷（DODAP）或1,2-二亚油基氧基-3-二甲氨基丙烷（DLin-DMA）进行了开发，以克服这些缺点并实现更好的功效。这些材料在生理pH下是中性的，允许全身性传递，但可以带正电以促进与DNA的脂质复合物形成并促进内体逃逸。值得注意的是，庚三十烯-6,9,28,31-四烯-19-基4-（二甲基氨基）丁酸酯（DLin-MC3-DMA）是siRNA传递的“黄金标准”，因为其相对于比较物具有优越的基因沉默活性，并成功应用于Onpattro，第一个获得FDA批准的siRNA治疗药物。除了这些疏水碳链脂质外，胆固醇及其衍生物是另一类可用于基因传递的脂质。其中的一个衍生物，DC-Chol，目前已经商业化，并在临床试验中用于癌症基因治疗。
双子表面活性剂是一种新兴的脂质类群，可用于基因传递。它们是两个表面活性剂单体，通过间隔基团通过共价键连接的头基组。双子表面活性剂通常比相应的表面活性剂单体具有较低的CMC（临界胶束浓度），导致较低的表面张力、更高的溶解能力等。因此，在传递系统中需要的该载体数量减少，毒性相应减少。最近，研究重点放在了双子表面活性剂的结构与生物活性的阐明上。例如，Jin等人比较了三种结构类似的双子表面活性剂，16-3-16、16(Py)-S-2-S-16(Py)和16-7N(G.K.)-16，它们的尾部都具有相同数量的碳。发现以甘氨酰-赖氨酰二肽为头基组的16-7N(G.K.)-16的转染效率比未经取代的16-3-16或含有吡啶基的16(Py)-S-2-S-16(Py)都要高得多。脂质样化合物
脂质样化合物是通过氨基与亲脂性丙烯酸酯、丙烯酰胺或环氧化合物的共轭而合成的类脂质材料。由于其无溶剂和催化剂的合成过程，脂质样化合物变得十分吸引人。这种快速简单的合成方法使得能够筛选出具有多样结构的脂质样化合物库。早在2008年，Aknic等人合成了超过1200种脂质样化合物，并证明其在小鼠、大鼠和非人类灵长类动物中具有有效的基因转移和表达作用。最近，Molla等人应用硫内酯化学方法制备了13种脂质样化合物。这些材料被制成脂质体用于传递siRNA，并在HeLa-GFP细胞中进行了测试。其中五种配方显示出比商业试剂更优异的基因沉默效率，强调了脂质样化合物结构对转染能力以及脂质体配方属性（如粒径）的重要性。这些发现可能为将来进一步探索脂质样化合物用于基因传递打下基础。
辅助脂质
基于脂质的基因传递系统通常利用“辅助脂质”来增强转染效率、稳定粒子或改善细胞内转运。与带正电和可离子化的脂质相比，辅助脂质是中性材料。1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）是最常用的辅助脂质之一，由于其锥状分子形状，有利于膜融合和/或双层破坏。此外，胆固醇也被用作辅助脂质，因为它可以增强细胞膜流动性并稳定脂质体制剂中的双层脂质，从而提高效力和稳定性。Sasayama等人利用胆固醇开发了一种基于1,2-二硬脂酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（聚乙二醇-2000）的纳米粒子配方LNPK15。这种配方在小鼠和猴子中的半衰期分别为15.2小时和27.0小时，并且表现出了强效的基因沉默效率。多肽是通过肽键连接的2-50个氨基酸残基的短链。它们具有生物相容性和可降解性，并且可以根据需要设计成为自组装纳米结构的构建块。遗传物质通过共轭或静电力与多肽相互作用形成肽-核酸复合物，从而促进传递。肽核酸（PNA）共轭物由肽基团和核酸基团通过共价键连接而成。它们是稳定的、不带电荷的分子，能够抵抗核酸酶降解，对酸性和碱性pH以及高温也不敏感。最近，Altrichter和Seitz制备了一种基于肽核酸的反义模块，包括Smac模拟化合物（SMC）。通过结合细胞穿膜肽，SMC-PNA导致细胞FLICE样蛋白的几乎完全下调。多肽是用于基因传递的主要肽类之一，包括聚（L-赖氨酸）（PLL）、聚（L-精氨酸）（PLR）和聚（L-谷氨酸）（PGA）。最广泛使用的PLL具有其侧链的高电荷密度，能够有效地使DNA凝聚。已报道PLL/质粒DNA（pDNA）复合物易于通过内吞作用摄取，其大小约为100 nm。然而，其低转染效率和亚优的内体逃逸限制了其应用。已经改性PLL，添加了各种功能基团，如PEI或棕榈酸，以提高效果。它还与其他肽类结合以克服内体逃逸不良。Zhang等人用谷氨酸修饰的肽（AR-23）制备了PLL/DNA复合物，促进了内体逃逸并增强了溶解活性。多肽还可以设计成树状结构，其中在核心、分支、树状结构表面或三个单位的任何组合中使用氨基酸作为构建块。肽树状结构体可能提供必要的带正电基团与遗传物质形成复合物、通过细胞膜的可能性以及逃逸内体所需的缓冲容量。例如，PLL树状结构体可以利用其柔性分支树状结构和核心中的赖氨酸。最近的研究将氨基酸的选择从赖氨酸扩展到精氨酸或其他取代品，为PLL树状结构体作为基因传递载体带来了额外的好处。这些努力改变了树状结构体的灵活性和电荷分布，提供了与核酸的额外相互作用并增加了细胞摄取的能力。树状结构体系统还可以将脂质或聚合物结合起来以获得更大的效果。已经证明通过添加聚醇到脂质/树状结构体混合物（49）或聚合物辅料，如聚乙烯醇18（PVA 18），可以增强转染。除了多肽外，还开发了许多功能性肽。这些肽在结构中具有特定的序列，从而产生各种好处，如增强细胞穿透性或靶向性。例如，细胞穿透肽（CPP）是小肽，可以轻松穿过细胞膜并促进基因材料的运输。作为常用的CPP之一，转录激活子（TAT）蛋白最近在使用多细胞瘤球作为细胞模型对实体肿瘤进行了评估。结果显示，更高浓度的TAT显著增加了肽的摄取量。除了TAT，穿透肽、GALA、transportan及其衍生物，如PepFect和NickFect，也因其细胞穿透能力而受到关注。一些其他肽能够通过识别细胞表面的受体来靶向特定细胞，从而提高效率并减少毒性。已经发现或合成了各种靶向肽，例如RGD肽和转铁蛋白（Tf）。还有一些额外的Tf受体结合肽引起了人们的兴趣，以提高靶向能力，如T7肽。顾等人应用T7修饰的多肽纳米颗粒CRD-PEG-T7，传递pPMEPA1的pDNA，用于骨转移性前列腺癌的治疗。他们发现T7的加入抑制了肿瘤的生长，并延长了携带肿瘤的小鼠的生存时间。无机材料比有机材料更稳定，也被用作基因载体。事实上，上世纪60年代报道的第一个非病毒基因传递就是基于磷酸钙的（54）。如今，更常见的无机载体包括硅基系统，如介孔硅纳米颗粒、金纳米颗粒、磁性纳米颗粒、碳纳米管、石墨烯、上转换纳米颗粒和量子点（55, 56）。金纳米颗粒相对较少毒性，并且可以与聚合物和脂质载体配制。刘等人构建了一种用于帕金森病治疗的金纳米颗粒复合物，其中pDNA被吸附在带正电的金纳米颗粒表面，并被封装到脂质体中，然后附着了靶向NGF和DHA。注意到该系统通过改善小鼠的运动和非运动功能，显著展现了神经保护作用（57）。碳纳米管是另一种有吸引力的载体，由单个或多个石墨烯片组成，尺寸从数百纳米到数十微米不等。碳纳米管促进基因通过细胞膜渗透，独立于哺乳动物细胞的内吞作用过程。借助分子动力学模拟，Liang等人发现碳纳米管通过降低这一过程的自由能，协助核苷酸穿透脂质膜（58）。2020年，合成了一种与Caspase3的siRNA连接的单壁碳纳米管用于治疗心血管疾病。这种基因载体显著提高了转染效率，导致更大的Caspase3基因沉默（59）。
具有高效基因转染和低细胞毒性的非病毒载体一直是基因传递领域的一把双刃剑。一些近期的尝试旨在提高转染效率的同时降低细胞毒性，包括无机-有机混合载体、改性PEI载体、无机-脂质载体和肽-脂质载体。无机-有机混合载体已被确定为新型非病毒载体类别中的一个增长趋势，可以实现平台或靶向基因传递到各种细胞类型。其中一种尝试是将甘露醇基团纳入载体中。2020年，马等人受到多羟基化合物甘露醇在临床上作为渗透剂的启发，构建了具有受控细胞摄取和随后细胞内转运的仿生非病毒载体，首次引入了基于甘露醇的有机-无机混合非病毒载体钙磷酸甘露醇阿伦膦酸酯（CaP-MA）。这种具有甘露醇基团的新型载体可以模拟穴窝介导的细胞摄取，并以非破坏性途径传递基因负载物，随后避免在溶酶体中降解基因。因此，这些载体在转染、生物相容性和毒性方面表现出优于未改性的CaP纳米颗粒的性能。另一个降低细胞毒性的尝试是使用无胺载体来对抗胺相关毒性。Choi等人开发了一种非常规的非病毒载体，利用介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）作为生物相容性试剂，以顺序、累积和定向的方式加载siRNA。通过磷酸根和MSN的非带电裸表面之间的钙离子介导的相互连接（钙粘合），建立了这种载体。结果表明，非带电的MSN基于钙粘合策略可能作为RNAi传递的一般非病毒载体平台，展现了潜力，这可能为其在基因传递中的应用提供了额外的研究机会。改性的PEI载体
PEI载体面临的最大挑战是细胞毒性，这是由于非可降解的酰胺键的存在，导致在正常细胞中积累并破坏代谢活性。已知细胞毒性的程度与聚合物分子量呈正相关。因此，降低毒性的一个有希望的策略在于具有配体修饰的低分子量PEI，例如那些包含叶酸或各种功能肽的PEI。于等人证明了由环糊精接枝的低分子量PEI（CD-PEI800）制备的自组装纳米粒子（SNPs）对Jurkat细胞具有低细胞毒性和高转染效率。他们推测，由CD-PEI800生成的阳离子水凝胶有助于SNPs的增强基因封装效率。2020年，Steinman等人合成了第一个三胺环丙烯基交联线性PEI（PEI/TAC）纳米粒子载体，以降低PEI的毒性。他们发现与未改性的PEI制备的相比，DNA的载体颗粒更小，这对细胞摄取产生了积极影响。TAC的交联增加了聚合物的阳离子电荷，使其能够结合遗传物质并促进溶酶体逃逸，从而提高了整体转染效率。与此同时，引入细胞的聚合物量的减少进一步降低了毒性效应。使PEI具有生物相容性并降低毒性的另一种方法是通过聚乳酸-聚甘醇酸（PLGA）纳米粒子与精氨酸修饰的PEI聚合物（AnPn）的组合（66）。AnPn的添加显着提高了pDNA的核定位和在人类星形胶质细胞中的成功基因表达。使用脂质体的一个挑战是转染效率低。Lebrón等人生成了阳离子金属脂质体钌（Ru）和磷脂质的复合物，以增加多阳离子并增强转染效率（67）。他们还发现转染受到Ru脂质的长度和疏水性的影响。这些载体获得的正转染效率表明了它们作为基因治疗中的纳米载体的可能性。此外，它们的大小和表面电荷通过不同的脂质与DNA的质量比影响了DNA的紧密结合，进一步防止了核酸的降解。有趣的是，Ru脂质载体对正常细胞的毒性比对癌细胞的毒性要小，这对于靶向基因治疗有希望。基于肽的阳离子脂质是另一类用于核酸递送的有前景的非病毒载体。赵等人合成了两种含有三赖氨酸头（LOrn3）和单赖氨酸头（LOrn1）的肽脂质，并研究了脂质体介导的基因递送的相互作用动力学。两种脂质体复合物被用作将绿色荧光蛋白（GFP）递送至Hela和Hep-2细胞的载体。转染效率显着受到肽脂质的电荷比的影响。在电荷比为4:1和3:1时，LOrn1和LOrn3对Hela细胞的转染效率最高，毒性最低。尽管两种肽脂质载体具有类似的化学结构，但LOrn3含有更多的氨基团，这产生了细胞内摄取和更高的质子缓冲能力。因此，LOrn3导致了更好的内体逃逸和DNA释放以及比LOrn1更有效的转染。该研究为未来肽-脂质载体的进一步研究方向提供了理论见解。为了在靶细胞中产生治疗效果，基因递送系统需要在血管中足够稳定，以被运送到细胞间的作用位点。随后，它们必须附着在细胞膜上，进入细胞，从内体逃脱到细胞质，并释放治疗基因从载体材料中（图2）。此外，如果传递pDNA，则还必须扩散通过细胞质并进入细胞核。因此，为了设计一个具有足够功效的适当基因递送系统，了解基因载体和递送系统属性对基因转染效率的影响至关重要（图3）。
车载材料的化学结构和属性是成功基因递送的主要考虑因素。人们已经开始建立结构活性关系（SAR），以了解分子结构的影响，并促进基因载体的设计。已经对聚合物和脂质材料的SAR进行了调查。例如，Buck等人将短链氨基脂质与DOTAP:chol基脂质复合物相结合，发现较长的脂质尾（C12）与较短的脂质尾（C10）相比，改善了minicircle DNA的转染效率。通过构建一系列α-环糊精-纤维素聚醚，其中使用不同分子量的聚乙二醇（PEG），Ghodke等人证明了研究中含有最大PEG（PEG 1500）的复合物与较小PEG（PEG 200、400和600）相比，在Turbo GFP siRNA上具有最少的沉默效率。电离状态是载体材料的关键性质之一。具有pKa为5.5–6.5的脂质材料有利于体内效力。对于基于聚合物的载体，尚未建立一般规则，因为调查正在进行中。例如，Routkevitch等人最近报告说，使用缓冲范围较窄的聚（β-氨基酯）（PBAE）导致对pH更敏感的转染水平。车载材料与基因的比例在转染效率中起着至关重要的作用，因为它可以影响车载-基因复合物的结合能力和理化性质。Neves等人对不同氮/磷（N/P）比率下的肽RALA/p53编码pDNA载体进行了表征。他们发现，与N/P为2相比，N/P为5到10的系统具有更小的粒径、更正电荷的表面和更高的pDNA包封能力，从而导致更好的细胞内摄取、更高的p53蛋白表达水平以及在使用HeLa细胞时更大范围的细胞凋亡。Sainz-Ramos等人开发了基于2,3-二（十四烷氧基）丙烷-1胺（DTPA）的nioplex配方，其中包括三种不同的脂质与DNA比例，以传递CFTR基因用于治疗囊性纤维化。他们指出，脂质与DNA比例为5/1的配方比2/1或10/1的配方具有更高的转染效率。纳米颗粒大小
纳米颗粒的大小是影响传递过程中所有步骤的关键因素。通常，大约100纳米的较大尺寸有利于在血液中长时间循环，但相对较小的载体可以更有效地渗透细胞。小于5纳米的颗粒可以通过肾脏滤过清除，而大于200纳米的颗粒则可以通过脾脏和肝脏的滤过清除。颗粒大小还会影响细胞摄取的机制和速率。例如，大于1微米的颗粒通过吞噬作用被细胞摄取，而大约200纳米的颗粒更容易通过克拉锡或洞窥体介导的摄取途径。然而，很难定义一个最佳转染效率的颗粒大小范围，因为大小效应高度依赖于载体类型和细胞摄取途径。Xia等人比较了商业上可获得的金纳米颗粒（尺寸范围为5-50纳米）的细胞摄取、细胞毒性和生物分布情况。观察到颗粒大小增加导致肝癌HepG2细胞的摄取增加，但对正常细胞L02的摄取减少。5纳米金纳米颗粒显示出最高的毒性，而50纳米的纳米颗粒在血液中维持时间最长。此外，Haddick等人制备了尺寸在60-160纳米范围内的各种介孔二氧化硅纳米颗粒。他们注意到，尺寸为160纳米的纳米颗粒显示出最快的细胞内摄取和最佳的基因沉默效果。推测较大的尺寸可能导致颗粒与细胞膜之间的接触表面积增加，从而导致更多的内吞作用。当基于它们的静电相互作用形成载体-基因复合物时，介质的pH值和离子强度可以改变复合物的平衡。因此，复合物的物理化学性质和它们的效能可能会受到很大影响。Chivu等人评估了在pH 7.4或12磷酸盐缓冲液中制备的聚（己亚胺大胍）/pDNA纳米颗粒。他们的研究发现，由于大胍基团的电荷密度较高（pKa≈12），纳米颗粒在pH 7.4时具有更高的ζ电位。因此，当负载荧光标记的寡聚脱氧核苷酸时，与在pH 12时相比，聚合物复合物在HepG2、HEK293T、HeLa细胞系中的细胞摄取增强。Chroni等人合成了一种磁性聚合物复合物，包括一个二嵌段共聚物、亲水性阴离子磁性纳米颗粒和短的脱氧核糖核酸。通过动态光散射测量，发现这种磁性聚合物复合物在低NaCl浓度下的强度保持不变，随着离子强度的增加而逐渐减少，因为较高的离子强度会导致DNA与载体之间的相互作用减弱，从而减少复合物的数量。药物传递系统中使用的赋形剂预计会影响制剂的性能。Keil等人设计了一种用于局部肺部疾病治疗的基因疗法的纳米嵌入微粒（NEM）粉末。NEM是通过将含有聚乙烯亚胺和核酸的聚合物复合物与惰性赋形剂曼尼托或海藻糖一起喷雾干燥制备而成。发现曼尼托制备的干燥颗粒的气动直径要大得多，并且在重新溶解后还增加了聚合物复合物的颗粒大小。此外，与海藻糖相比，含有曼尼托的干燥粉末显示出低溶解度，阻止了对其生物学特性的评估。Wickline等人最近发现，意外地使用透明质酸提供了一个更均匀的纳米粒子大小分布，而不会使阳离子两性肽和RNA配方聚集。新型透明质酸纳米粒子的效果也比其他纳米粒子配方更有效，这表现在10倍低剂量的siRNA能够抑制腹主动脉瘤。此外，透明质酸纳米粒子还与mRNA结构形成复合稳定的纳米粒子，足够小以穿透软骨，从而实现在该组织中的mRNA的传递和转译。综合起来，证据可能表明，选择制剂成分是另一个需要研究的方面，以改善对细胞的转染和基因传递系统中的稳定性。除了制剂成分外，纳米粒子制备方法也可能影响其性质。Pezzoli等人采用了两种方法制备PEI-pDNA聚合物复合物。一种是滴加模式，其中将pDNA一次性滴加到聚合物溶液中，然后让复合物溶液静置。另一种是混合模式，其中pDNA通过剧烈上下振荡的方式与聚合物溶液混合。研究表明，滴加模式生成了较大的纳米粒子，导致显著更高的转染效率。近年来，基因治疗在多个治疗领域中针对各种特定细胞群体取得了突破。2014年，Yin和Anderson等人对利用非病毒载体进行基因治疗的机制性挑战进行了详细回顾。虽然非病毒载体需要具备保护基因材料免受内切酶降解以实现转运到细胞核和核内摄取、载体解包等特征，但通常需要定制化系统。此外，传递系统应根据不同的治疗方式设计。将DNA转运到细胞核对其治疗效果至关重要，因此相对较大的粒径对功效构成额外挑战。与DNA相比，RNA不需要进入细胞核进行表达，但稳定性较差。此外，细胞与载体之间的相互作用因不同的模式而异，这极大地影响了转染效率。迄今为止，选择非病毒载体传递系统的一揽子方法尚不可行。正如最近获得FDA批准或紧急使用授权的三种基因传递产品所示，这些产品都使用脂质纳米颗粒作为载体，但每种产品都定制了自己的脂质系统，即使Moderna和Pfizer/BioNTech都为COVID-19预防而提供了mRNA疫苗。此外，载体系统可能非常复杂。例如，Pfizer/BioNTech疫苗必须使用一组4种脂质；一个可离子化阳离子脂质来封装带负电的mRNA，一个PEG修饰脂质来帮助控制粒径，二十二烷酸二酰基磷脂胆碱（DSPC），一种磷脂，以及胆固醇以有助于形成脂质纳米粒子的结构。由于载体配方的复杂性，筛选出成功的载体需要巨大的努力。据报道，在开发patsiran，一种siRNA药物时，需要筛选超过300种可离子化脂质。最近，GuidTx开发了一种高通量技术来筛选脂质纳米粒子系统，这有望提高选择非病毒载体进行基因传递的效率，并提高精确性。开发有效且安全的基因载体需要对遗传物质和载体的物理化学和生物学特性、靶细胞的生理学以及分子水平上载体诱导的转染机制有全面的了解。例如，不同靶细胞类型之间细胞膜电荷的差异为研究和修改非病毒载体以实现特定遗传负载在特定细胞类型中达到期望疗效提供了许多研究机会。除了疗效外，开发者还应注意毒性问题。虽然非病毒基因载体具有比病毒载体更低的免疫毒性，但不容忽视的是纳米粒子可能会引发免疫反应。例如，已发现壳聚糖能引起小鼠树突状细胞、腹膜巨噬细胞和人外周血单核细胞的IL-1β反应。二氧化硅纳米颗粒导致促炎细胞因子分泌增加，并显示能激活巨噬细胞分泌IL-1β。免疫毒性取决于载体材料和细胞类型，因此需要具体问题具体分析。毫不奇怪的是，大多数近期关于新型非病毒载体的研究出版物都集中在改善载体性能特性方面，如大小、表面电荷、转染、细胞毒性以及细胞内外的运输。与此同时，较少的出版物从产品开发的角度报道研究，特别是与载体在配方制备和产品储存期间的物理化学稳定性有关的研究。例如，值得研究的是配方缓冲液的离子强度和pH值对非病毒载体稳定性的影响，因为这些因素可能影响载体的转染效率或改变其潜在的临床应用。此外，冷冻或冷藏常用于存储基因治疗配方。因此，在给药前的冻融应力和温度升高可能会损害基因治疗的有效性，例如通过触发纳米粒子大小分布、聚集潜力或化学降解的变化。另一方面，基因治疗产品表征的稳定性指示技术尚未得到很好的建立，限制了该领域研究的工具。此外，非病毒基因传递系统在将药物从实验室带到床边方面也呈现出复杂性。根据质量设计原则，定义适当的关键质量属性和关键过程参数不仅是为了保证产品质量，还可以加速产品开发过程。由于基因载体本质上是可变的，生产过程涉及活细胞，因此控制物质杂质并确保批间一致性是具有挑战性的。在建立规范接受标准时，还必须了解产品属性与其安全性和有效性之间的关系。最后，非病毒载体基因治疗的配方设计仍处于初级阶段。各种方法正在迅速发展。Chen等人最近将疏水前药纳入基于脂质的纳米颗粒基因传递系统中，这提供了一种方便的方法来避免基因药物配方的全身给药引起的免疫刺激后果。未来有许多研究机会，可以研究和了解非病毒载体基因治疗配方对临床应用的属性和影响。在当前注册于ClinicalTrials.gov的110项即将进行的基因治疗试验中，病毒载体仍然是主要的基因传递系统；只有Sigilon Therapeutics进行的一项I/II期试验应用非病毒载体传递基因修改的细胞系。与此同时，近年来有许多有关各种非病毒载体的临床前研究和发表，无疑展示了基因传递领域的迅速发展。尽管存在许多挑战，但Moderna和Pfizer-BioNTech的COVID-19紧急使用疫苗成功地利用基于mRNA的脂质纳米颗粒，并分别达到了94.5%和95%的预防COVID-19有效性。值得注意的是，这两款疫苗是在如此短的时间内开发出来的。这些最近的成功为未来发现更多有效和安全的非病毒载体基因治疗产品带来了兴奋和希望。
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