单细胞+机器学习经典组合助力肿瘤预后研究，结合代谢热点，轻松拿捏一区5+SCI

Biology Direct 上发表的新文章通过综合分析多组学数据揭示了色氨酸代谢在肾透明细胞癌中的重要作用，并开发了一个色氨酸代谢相关预后模型 TMRS ，为个性化治疗提供了新视角。

数据来源： 从公共数据库（ GDC、PDC、GEO 和 TCGA 等）和过往研究获取6个公共数据集，其中 GSE156632 用于单细胞研究和模型验证。

单细胞分析： 使用R包 Seurat 处理数据和标准化分析，并用 Monocle2 算法重构上皮细胞发育轨迹。

通路活性与基因富集分析： 使用R包 AUCell 评估单细胞水平活性；使用R包 GSVA 在细胞层面上评估色氨酸代谢通路活性，并利用 ssGSEA 算法计算基因集富集分数。

共表达网络分析： 使用R包 WGCNA 和 hdWGCNA 构建共表达网络，识别与色氨酸代谢相关的基因模块。

模型构建和评估： 通过 Cox 回归分析筛选出与预后相关的色氨酸代谢相关基因，随后对 TCGA 训练集应用10种机器学习算法的246种组合来构建预后模型；对其他数据集使用 C-index、Kaplan-Meier 分析和 ROC 曲线等方法评估模型准确性。

实验验证： 通过 qRT-PCR、Western blot、CCK8 实验和 transwell 实验在临床样本和细胞系中验证基因表达差异和功能影响。

肾透明细胞癌肿瘤细胞中色氨酸代谢发生异常改变

目的： 通过单细胞 RNA 测序数据（ GSE156632 ）来评估色氨酸代谢在 ccRCC 中的作用。

结果：

1. 在 ccRCC 患者的肿瘤样本和相邻正常样本中，发现色氨酸代谢通路富集分数在不同上皮细胞中存在显著差异，表明色氨酸代谢与上皮细胞的不同生物学状态相关；

2. 上皮细胞的亚聚类和注释确定了这种差异主要源自近端小管细胞；

3. 将近端小管细胞被进一步细分为正常、过渡（表达正常近端小管和恶性细胞标记）和恶性细胞，而色氨酸代谢分数在这些细胞类型中逐渐下降，表明其参与了近端小管细胞的恶性转化（图1A）；

4. 拟时序分析显示，色氨酸代谢评分随着拟时间的增加而稳步下降，进一步支持色氨酸代谢异常在细胞恶性转化起重要作用（图1B）。

图1

鉴定与色氨酸代谢相关的 Hub 基因

目的： 识别 ccRCC 中单细胞和批量 RNA 测序数据中与色氨酸代谢相关的 hub genes 。

结果：

1. 对近端小管细胞进行了 hdWGCNA 分析，确定了6个不同颜色模块基因，其中绿松石模块的特征基因与色氨酸代谢富集分数关联最强（图1C）；

2. 对 TCGA-KIRC 队列的转录组数据进行WGCNA分析，发现紫色模块基因与色氨酸代谢富集分数的相关性最高（图1D）

3. 结合 hdWGCNA 和 WGCNA 分析结果确定了142个共有的色氨酸代谢相关基因（图1E）

4. 单因素 Cox 回归分析表明，这142个基因中有35个与患者预后显著相关，这些基因被选为进一步分析的对象（图1F）。

图1

集成机器学习方法构建模型与性能评估

目的： 通过集成机器学习方法构建最优预后模型并评估其性能。

结果：

1. 将 TCGA-KIRC 数据集按7:3的比例随机分为训练集和内部验证集，并用不同机器学习组合进行基因筛选和模型构建，其中 SC(bwd）+GBM 组合的模型最优（图2A）；

2. 基于 AIC 值从35个基因中选择了11个基因构成 TMRS ，这11个基因在模型中的重要性和部分依赖图表明了每个基因对模型预测的贡献和影响（图2B，C）；

3. TMRS风险评分与“ KEGG_Tryptophan_Metabolism ”特征的ssGSEA富集分数呈负相关，表明 TMRS 能准确反映 ccRCC 中色氨酸代谢状态（图2D）；

4. 高风险 TMRS 组的患者总体生存率（ OS ）显著较差，且与较差的 PFS 相关（图2E）；

5. ROC 曲线分析显示 TMRS 在预测1年、3年和5年生存率方面具有较高的 AUC 值，进一步证实T MRS 的预测能力（图2F）。

图2

列线图构建

目的： 评估 TMRS 的独立预后价值并构建列线图。

结果：

1. TMRS 风险评分在晚期疾病和高等级患者中更高，且在多因素 Cox 回归分析中显示出独立预后价值（图3A-C）；

2. 基于 TMRS 的列线图在预测 OS 和 PFS 方面表现出色，具有高 C-index 值和良好的校准曲线（图3D-F）；

3. 决策曲线（ DCA ）进一步确定了 OS 列线图的临床价值，展示了其指导治疗决策和有效改善患者护理的潜力（图3G）。

图3

探索 TMRS 对患者治疗结果的潜在机制

目的： 探究 TMRS 如何影响患者的预后。

结果：

1. UMAP 可视化显示， TMRS 风险评分不同的患者之间存在显著的生物学状态差异（图4A）；

2. Hallmark 特征的基因集变异分析确定了所有数据集中与 TMRS 显著相关的途径，包括与代谢、恶性肿瘤和免疫反应相关的途径（图4B）；

3. ESTIMATE 分析表明， TMRS 评分与免疫评分正相关，与肿瘤纯度负相关（图4C，D）；

4. ssGSEA 算法表明， TMRS 评分升高的患者中大多数免疫细胞的丰度更高，包括“抗癌”和“促癌”免疫细胞（图4E）；

5. CIBERSORT 算法结果显示，调节性T细胞和 M0 巨噬细胞均显著增加，而部分数据集中的 M1 巨噬细胞、单核细胞和静息肥大细胞显著减少（图4F）；

6. 这些结果表明高 TMRS 评分与更异常的代谢途径、增加的肿瘤恶性程度和增强的免疫反应相关，进一步支持 TMRS 作为预测 ccRCC 患者预后和治疗反应的潜在生物标志物的价值。

图4

TMRS 与预后的关联

目的： 分析 TMRS 在单细胞水平上与不良预后和更高恶性程度的关联。

结果：

1. 单细胞转录组分析证实了上述发现， TMRS 风险评分从正常细胞到过渡细胞，再到恶性细胞逐渐增加，强调了 TMRS 与恶性程度的关联（图5A-C）

2. Scissor 算法分类结果显示， Scissor +恶性细胞表现出显著更高的 TMRS 风险评分和更高比例的高风险细胞，强调了高 TMRS 与不良预后的强相关性（图5D-F）。

3. 单细胞水平的通路分析结果显示，与 TMRS 风险评分正相关的 HALLMARK 特征主要与免疫（如异体移植排斥、干扰素γ反应和炎症反应）和肿瘤恶性程度（如上皮-间质转化、 E2F 靶标和 G2M 检查点）相关，而与 TMRS 风险评分负相关的途径主要涉及代谢过程（图5G，H）。

4. 这些结果与批量转录组分析结果一致，并且与 TMRS 水平较高的患者预后明显较差的情况相一致。

图5

TMRS 与基因组特征以及患者治疗反应之间的关联

目的： 探讨 TMRS 与 ccRCC 患者的基因组特征以及对免疫疗法和靶向治疗的响应性之间的关联。

结果：

1. 高 TMRS 风险评分的患者有出更高的特定肿瘤抑制基因（如 SETD2、BAP1 和 KDM5C ）突变频率和更多的拷贝数变异，表明高 TMRS 评分与基因组不稳定性有关（图6A，C，D）；

2. 高 TMRS 风险评分患者的 MATH 评分显著升高，而 TMB 水平没有显著差异，表明高 TMRS 评分可能与肿瘤内部异质性增加有关（图6B）；

3. TIDE 分析显示 TMRS 风险评分与 TIDE 评分和T细胞功能障碍评分正相关，表明高 TMRS 评分的患者可能对免疫疗法的反应较差（图6E-H）；

4. 在免疫治疗队列中，高 TMRS 风险评分的患者总体生存率和无进展生存率显著降低，进一步证实高 TMRS 风险评分的患者对免疫治疗的反应减弱（图6I，J）；

5. 通过 OncoPredict 算法进行药物预测，发现高 TMRS 风险评分的患者对卡博替尼和索拉非尼的敏感性增加，表明这些药物可能在高 TMRS 评分的患者中更有效（图6K）。

图6

实验验证 TMRS 基因异常表达及 DDAH1 在肿瘤恶性化中的作用

目的： 验证 TMRS 中基因的异常表达以及 DDAH1 在肿瘤恶性中的作用。

结果：