同济大学戴晓虎团队ER：污泥源生物刺激素提高稻米中抗炎活性物质含量

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近日，同济大学环境科学与工程学院戴晓虎教授团队与中国土木工程学会水工业分会张悦理事长团队在 Environmental Research 期刊合作发表了题为 “Sludge-derived biostimulants promote glycosylation of tricin and luteolin in the flavone and flavonol biosynthesis to enhance anti-inflammatory activities of rice” 的论文 。本研究 调查了在生产规模施用污泥源生物刺激素（ SS-BS ）对稻米品质的影响。研究表明，经 SS-BS 处理的稻米满足优质稻米安全标准。 SS-BS 能明显提高稻米中胚乳的营养物质富集度，使蛋白质、维生素 B1 、膳食纤维和维生素 E 的含量分别提高 7% 、 7.2% 、 23.2% 和 42.2% 。此外， SS-BS 还能上调 FG2 基因，从而增加茄红素含量，并激活 UGT73C6 和 CYP75A 的基因表达，这两种基因能催化 O- 糖基化并促进糖基转移。 SS-BS 可抑制 Trifolin, Scolymoside 和 Swertiajaponin 的合成，从而有利于 Tricin 和 Luteolin 糖基化衍生物的合成，而糖基化衍生物具有更高的抗炎活性。此外，两个新基因 novel.2100 和 novel.1300 以及一个未定性基因 LOC9269295 与抗炎和抗氧化化合物的产生密切相关。这项研究揭示了 SS-BS 影响作物品质的调控机制，为其高值化应用提供了新的证据，有助于功能性食品和可持续农业的发展 。

近年来，随着全球健康趋势的变化，功能性食品的营养和功能增强受到了越来越多的关注。功能性食品不仅提供基本营养，还提供额外的健康益处。其中，稻米作为一种广泛消费的主食，成为营养增强的关键目标。增加稻米中类黄酮和黄酮醇等生物活性化合物的浓度，可以显著提高其抗氧化能力，从而有助于降低慢性疾病的风险。此外，市政污泥作为污水处理的副产品，既是一个环境挑战，又是一个宝贵的资源。通过将污泥转化为生物源刺激剂，前期研究已经证实 SS-BS 在提高作物产量和抗逆性方面表现出色，同时可以增强土壤肥力而不会对土壤微生物造成伤害，同时促进可持续农业实践。本研究旨在调查 SS-BS 对稻米品质在农业生产规模上的影响，尤其是稻米中的功能性化合物含量方面，从而为功能性食品的开发和可持续农业实践做出贡献 。

图文导读

在试验设计中， SS-BS 在整个水稻生长周期中施用于叶面，而对照组（ CK ）施用农业生产中常用的常规缓释掺混肥（氮、磷、钾含量 >51% ，缓释氮 >15% ）。 CK 和 SS-BS 两块稻田分别位于中国浙江省某村镇一条道路的左右两侧。水稻于 2023 年 5 月 27 日播种。 7 月 15 日、 8 月 20 日和 9 月 18 日喷施 SS-BS 或肥料， 11 月 5 日在水稻成熟期采集稻米样品。为尽量减少个体差异造成的误差，在生长一致多株水稻上选择相同位置（同侧光、同高度）的 20 粒稻米作为每组内的一个生物学重复，每组做 3 个生物学重复。用于代谢组学和转录组学分析的样品在液氮中速冻 5 分钟后，保存在 -80 ^o C 温度下备用 。

喷洒 SS-BS 改变稻米代谢物特征

表 1 精米、糙米和胚乳的营养成分比较。

CK ：对照组，施用常规缓释混合肥料（ N 、 P 、 K 含量 >51% ，缓释氮 >15% ）； SS ：污水污泥衍生生物刺激素组； OECD ：经济合作与发展组织； ILSI ：国际生命科学研究所作物成分数据库

Figure 1 SS-BS 与 CK 组的代谢物特征： (A) 检测到的代谢物总体分布； (B)CK 组与 SS-BS 组的主成分分析 (PC1 与 PC2 分别为 28.4% 和 24.3% ) ； (C)SS-BS 与 CK 组的差异代谢物分类热图

通过喷洒 SS-BS ，稻米中实验组和对照组共检测 1139 种代谢物 ，其中检测到的黄酮类物质最多共 242 种，其次是脂质类物质 204 个、酚酸 144 个、生物碱 94 个、萜类 81 个、木脂素和香 豆素 68 个、氨基酸和衍生物 64 个、有机酸 41 个、核苷酸和衍生物 38 个、醌类 16 个、鞣质 2 个 (Figure 1A) 。基于自建数据库代谢物检测图谱显示的代谢物，检测到更多样化的特征代谢物。与以往文献相比 (726 种代谢物 ) ，本研究检测到更多特征性代谢物，鉴定出更多具有相同分子式的异构体或衍生物。黄酮类、脂质类、酚酸类物质是稻米中检测到最多的种类，这些也是稻米中最常见的生物活性成分，可以为分析稻米功能特性提供更有价值的信息。 SS-BS 的施加使 69.4% 的特征代谢物出现显著性差异上调。根据分类热图显示， 脂质、萜类、黄酮以及酚酸类物质差异变化数量最多，这些类别中，差异代谢物的上调占很大比例 (73.9%) 。

喷洒 SS-BS 增加稻米的抗炎抗氧化活性成分

Figure 2 施加 SS-BS 对稻米代谢物差异影响： SS-BS 中抗炎类活性物质上下调情况比较 (A 为黄酮醇类物质、 B 为黄酮类物质、 C 为酚酸类物质 ) ； (D)SS-BS 与 CK 种稻米差异代谢物中特征抗炎抗氧化活性物质相对含量比较 (p<0.05)

喷洒 SS-BS 使得稻米中常见的抗炎、抗氧化物质 ( 黄酮醇、黄酮类、酚酸 ) 出现显著上调 (Figure2 A 、 B 、 C) 。黄酮类化合物具有清除体内多余活性氧自由基的能力。黄酮苷的糖基化、羟基化、甲基化等修饰都会影响其性质，增加黄酮药物相关特性的多样性。花青素、黄酮醇、黄酮类等亚类也可以防止氧化应激和细胞损伤。在本研究中，施加 SS-BS 使除山柰酚 -3-O- 半乳糖苷 ( 三叶豆苷 ) 外 12 种黄酮醇含量均升高，会比普通化肥的稻米显示出更高的抗氧化能力。特别的，检测到四种芹菜素衍生物、两种三甲氧基黄酮衍生物，和一种叶蓟素葡萄糖苷，其中一些衍生物以前没有在稻米中报道过，但均在 SS-BS 的施加后产生显著差异。这些多样化的天然生物活性物质及其衍生物的发现为稻米表现差异抗炎活性提供很好的证明依据。 Tyr-Abu-OH 、 LysoPC 10:0 、 Luteolin-6-C-glucoside-7-O-rhamnoside 这三个尚未被报道过的显著差异物质化学式分别为 C ₁₆ H ₂₀ O ₉ ， C ₁₇ H ₂₀ O ₉ ，前两个化学式一致，但其特征峰是芳香环与羟基结合的一类化合物，所以暂时将其分配为酚酸类物质，而由于苯环上的羟基极易失去氢电子，所以他们可以作为良好的电子供体而发挥抗氧化的功能，具有广泛的生物活性。稻米中的黄酮、黄酮醇以及酚酸被发现被各种糖苷大量修饰，据推测是稻米植物中的糖基转移酶催化，根据糖基的不同位置、类别和数量，形成多种糖苷类天然产物。而这些物质依然保留着原化学结构特性，具有一定的抗炎抗氧化天然活性。通过相关天然活性物质的增加，是判断抗炎抗氧化活性特异性的潜在途径。但具体的抗炎活性表现还需进一步实验的研究 。

施加 SS-BS 的特征抗炎抗氧化物质合成途径分析

Figure 3 ：黄酮醇和黄酮醇生物代谢通路图 ( 红色代表上调，绿色代表下调 ) 合成路径

稻米中的黄酮类化合物主要以 Tricin 、 Luteolin 两个中心代谢物为物质前体进行进一步合成。 SS-BS 的添加促进 Naringenin 单体积累从而可以进一步合成 Apigenin ，苯环上结合羟基取代基形成 Luteolin 。 Luteolin 是黄酮类代谢物，结构上的两个苯环和含氧环加上三个双碳的存在被证明具有抗氧化和抗炎的生物学特性，而 SS-BS 能够激活葡糖糖基转移酶，诱导 Luteolin 逐渐糖苷化，而其糖苷形式显示出更强的抗炎抗氧化特性。其次是第二个中心代谢物，由 Luteolin 进一步合成产生的 Tricin 。研究表明， Tricin 的不同形式具有植物保护功能，其含量的提升可以提高植物的抗逆抗虫特性，与 SS-BS 中具有水杨酸、茉莉酸具有作用一致性。由 Tricin 合成出多种衍生物， tricin-glycoside 的相对含量明显富集，在合成路径中 Tricin 没有明显差异的情况下， SS-BS 通过糖基化修饰以及与氨基酸偶联提高其自由基清除活性。最后是黄酮醇的生物合成，差异代谢物中显著差异的代谢物为 Nictoflorin ， SS-BS 上调 FG2 基因表达从而提高 Nictoflorin 相对含量，并且激活 UGT73C6 以及 CYP75A 的基因调控。 UGT73C6 是黄酮醇糖基转移酶，其过表达催化 O- 糖基化，将葡萄糖转移到 Nictoflorin 。研究表明， SS-BS 中含有的植物激素通过叶面施肥调节稻米次生代谢物的相对含量，显著提高黄酮含量，通过抑制 Trifolin 、 Scolymoside 、 Swertiajaponin 的合成，从而转向更具抗炎活性的 Tricin 、 Luteolin 的糖基化衍生物合成，从而提高稻米的抗炎抗氧化活性 。

喷洒 SS-BS 的转录蛋白调控抗炎抗氧化活性物质积累

Figure 4 DEG 的共表达分析及抗炎活性物质相关的共表达网络。 A 左侧表示基因模块分组情况及每个模块中的个数； B 抗炎活性物质相关的共表达网络 。

通过 WGCNA 边缘关系构建差异基因的相关节点。从 turquoise 和 blue 模块中共选择 5 个中心基因分别是 LOC4349655 、 novel.2100 、 novel.1300 、 LOC4344371 以及 LOC9269295 。前四个基因与三种物质的相对含量显著相关，可能在这些物质中发挥调控作用。有趣的是，鉴定到的 5 个基因中，有两个基因是新基因 ( 命名为 novel.2100 、 novel.1300 ，基因序列 Table S4) ，还有一个尚未表征的基因 (LOC9269295) 。根据 GO 注释以及 Pfam 基因功能注释分析， LOC4349655 为 ZF-HD 蛋白二聚区，该蛋白家族被认为参与同源与异二聚体的形成，并可能形成锌指，其受到外源植物激素的诱导，并参与到稻米果实发育中。 novel.1300 是 Cys-rich Gliadin N-terminal ，醇溶蛋白会与多酚物质相互作用，形成蛋白质多酚混合物，从而限制炎症介质的释放。 LOC4344371 的 Pfam 功能注释为 Wound-induced protein WI12 ，其伤口诱导的防御基因在对害虫和病原体感染起到保护作用，可以对茉莉酸等植物激素的影响做出表达响应。通过上述结论总结， SS-BS 中含有的植物激素 (IAA 、 JA 、 GA.elt) 可以作为应激信号分子，抑制 LOC4349655 、 novel.2100 、 novel.1300 、 LOC4344371 基因表达，其基因表达的下调激活次生代谢物合成，使稻米中积累差异抗炎活性物质 (Apigenin-4'-O-glucoside 、 5,6,7-trimethoxyflavone 、 LysoPC 10:0) ，并且可以诱导酚类生物合成，并增强抗氧化能力，从而改善营养品质，使其在非生物胁迫条件下抗氧化活性物质累积。除此之外，研究鉴定到 blue 核心模块中先前未表征的特异基因， LOC9269295 基因也与 5,6,7-trimethoxyflavone 、 LysoPC 10:0 两种物质的相对含量升高呈强正相关 。