本文题目是：环状RNA hsa-circ-0016347促进骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移（回复170502可下载文献，一周有效）
Oncotarget前两年在6.6左右，现在略低5.008。
今天批讲一篇RNA四大天王（LncRNA、miRNA、circRNA 、piRNA）之一的环状RNA（circRNA）。circRNA是一种非编码RNA，具有共价闭合的环状结构，研究发现其在转录后水平上表现出巨大的基因表达调控能力。
越来越多的证据表明，circRNA可以作为竞争性内源RNA与微小RNA（miRNA）结合并抑制靶向miRNA的活性和功能。
本文研究circ-0016347在骨肉瘤细胞增殖、侵袭中的调节作用。
收集6例骨肉瘤组织及相邻非肿瘤组织，qRT-PCR测定circ-0016347表达水平。骨肉瘤组织中circ-0016347表达水平高于相邻非肿瘤组织（Fig.1A）；
与正常成骨细胞OB3相比，骨肉瘤细胞系（Saos-2，MG-63）中circ-0016347的表达水平明显升高（Fig.1B）；
表明circ-0016347与骨肉瘤的发生具有很强的正相关性。
circ-0016347与骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移的关系
Saos-2和MG-63细胞转染siRNA后，通过qRT-PCR检测，与阴性对照相比，circ-0016347 siRNA转染组circ-0016347表达量显着下调（Fig.2A）；
CCK-8结果显示，与对照细胞相比，si-circ0016347转染显着降低了MG-63、Saos-2细胞增殖（Fig.2B）；
与阴性对照相比，circ-0016347敲除后降低了MG-63、Saos-2细胞的增殖（ Fig.2C）和侵袭（Fig.2D）能力。
异种移植小鼠模型，将过表达质粒pcDNA-circ-0016347转染Saos-2细胞，然后种植在小鼠皮下或尾静脉中。结果表明：circ-0016347过表达小鼠，肿瘤大小（ Fig.2E），肺转移瘤数（ Fig.2F）明显高于对照（空质粒）组。
研究表明caspase-1对肿瘤微环境的形成具有重要作用，有助于骨肉瘤细胞增殖和侵袭。因此，文章分析circ-0016347和caspase-1在骨肉瘤细胞增殖中的关系。
六例骨肉瘤组织中，circ-0016347高表达组caspase-1的表达水平明显高于circ-0016347低表达组（ Fig.3A-B）；
RT-PCR和WB显示，MG-63和Saos-2细胞中caspase-1水平高于OB3细胞（Fig.3C-D）；
siRNA沉默circ-0016347后，RT-PCR和WB检测，MG-63和Saos-2细胞中caspase-1表达水平降低（Fig.3E-F）；
免疫细胞化学测定，circ-0016347敲除后，骨肉瘤细胞增殖能力减弱（Fig.3G-H）；
这些结果表明：circ-0016347可能通过caspase-1表达量增加来促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。
鉴于近年来研究认为，circRNA和miRNA之间存在功能串扰，作者猜想circ-0016347是否和miRNA之间存在关系，来参与caspase-1调控骨瘤细胞增殖的过程。
使用TargetScan Human 5.1来查找和caspase-1之间存在碱基互补配对的miRNA，生物信息学预测显示：miR-214和caspase-1的3’UTR序列具有结合位点（Fig.4A）；
miR-214和caspase-1的 3'UTR结合，观察到荧光素酶活性降低（Fig.4B-C）；
继续进行miR-214功能缺失实验，转染miR-214模拟物后，caspase-1的mRNA和蛋白表达量显著降低；转染miR-214抑制剂组caspase-1水平显著增加（Fig.4D-E）；
这些结果证实caspase-1是miR-214的直接靶标。
circ-0016347和miR-214之间的功能串扰（天王间要斗法了~）
文献表明，circRNAs会封闭miRNA以终止其对靶基因的调控。因此，作者使用公共数据库miRanda、PITA和RNAhybrid，筛选circ-0016347靶向的某些miRNA。
发现miR-214具有人钾离子电压门控通道亚家族H1（KCNH1）的结合位点，并且已知KCNH1参与骨肉瘤的增殖、侵袭。circ-0016347具有KCNH1相应的线性序列（Fig.5A）；
为了进一步检验circ-0016347与miR-214，miR-214与caspase-1之间的关系：
分三组①对照组、②转染si-circRNA组、③ 转染si-circRNA+miR-214抑制剂组。然后，采用qRT-PCR、WB检测circ-0016347、miR-214和caspase-1表达。
在Saos-2和MG-63两个细胞系中，与阴性对照相比，si-circRNA转染组中miR-214的水平显着升高，miR-214抑制剂（AMO-214）组显著逆转了由si-circ-0016347引起的miR-214高表达（Fig.5B-C）；
caspase-1蛋白表达水平与其mRNA表达水平一致（Fig.5D-E）。
Circ-0016347作为miR-214海绵，miR-214对circ-0016347也具有相似的作用。circ-0016347与caspase-1呈正相关，这个过程可被miR-214抑制剂逆转。
从整体上看，circ-0016347与miR-214负相关，间接影响了骨肉瘤细胞中caspase-1的表达。
PS：miRNA海绵（miRNA sponge）一种长期抑制miRNA基因的高效方法，好像一块海绵吸满了miRNA，使其无法与天然靶点结合，其本质是一条mRNA，3’-UTR区域包含若干miRNA靶定位点。
感兴趣的客官可从Nature Methods自行查阅，这里就不展开了。
文章整体来说，换汤不换药，实验都是常见的，主角换成了circ-RNA蹭热门。感兴趣的小大夫们赶紧蹭蹭试试吧~
