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非编码RNA四天王之circRNA

解螺旋  · 公众号  · 医学  · 2017-05-02 18:01

正文

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作者:Lucky King(转载请注:解螺旋·医生科研助手)

  

本文题目是:环状RNA hsa-circ-0016347促进骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移(回复170502可下载文献,一周有效)



Oncotarget前两年在6.6左右,现在略低5.008。


今天批讲一篇RNA四大天王(LncRNA、miRNA、circRNA 、piRNA)之一的环状RNA(circRNA)。circRNA是一种非编码RNA,具有共价闭合的环状结构,研究发现其在转录后水平上表现出巨大的基因表达调控能力。


越来越多的证据表明,circRNA可以作为竞争性内源RNA与微小RNA(miRNA)结合并抑制靶向miRNA的活性和功能。


本文研究circ-0016347在骨肉瘤细胞增殖、侵袭中的调节作用。

 

收集6例骨肉瘤组织及相邻非肿瘤组织,qRT-PCR测定circ-0016347表达水平。骨肉瘤组织中circ-0016347表达水平高于相邻非肿瘤组织(Fig.1A);


与正常成骨细胞OB3相比,骨肉瘤细胞系(Saos-2,MG-63)中circ-0016347的表达水平明显升高(Fig.1B);


表明circ-0016347与骨肉瘤的发生具有很强的正相关性。



circ-0016347与骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移的关系


Saos-2和MG-63细胞转染siRNA后,通过qRT-PCR检测,与阴性对照相比,circ-0016347 siRNA转染组circ-0016347表达量显着下调(Fig.2A);


CCK-8结果显示,与对照细胞相比,si-circ0016347转染显着降低了MG-63、Saos-2细胞增殖(Fig.2B);


与阴性对照相比,circ-0016347敲除后降低了MG-63、Saos-2细胞的增殖( Fig.2C)和侵袭(Fig.2D)能力。


异种移植小鼠模型,将过表达质粒pcDNA-circ-0016347转染Saos-2细胞,然后种植在小鼠皮下或尾静脉中。结果表明:circ-0016347过表达小鼠,肿瘤大小( Fig.2E),肺转移瘤数( Fig.2F)明显高于对照(空质粒)组。



研究表明caspase-1对肿瘤微环境的形成具有重要作用,有助于骨肉瘤细胞增殖和侵袭。因此,文章分析circ-0016347和caspase-1在骨肉瘤细胞增殖中的关系。


六例骨肉瘤组织中,circ-0016347高表达组caspase-1的表达水平明显高于circ-0016347低表达组( Fig.3A-B);


RT-PCR和WB显示,MG-63和Saos-2细胞中caspase-1水平高于OB3细胞(Fig.3C-D);


siRNA沉默circ-0016347后,RT-PCR和WB检测,MG-63和Saos-2细胞中caspase-1表达水平降低(Fig.3E-F);


免疫细胞化学测定,circ-0016347敲除后,骨肉瘤细胞增殖能力减弱(Fig.3G-H);


这些结果表明:circ-0016347可能通过caspase-1表达量增加来促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。

 


鉴于近年来研究认为,circRNA和miRNA之间存在功能串扰,作者猜想circ-0016347是否和miRNA之间存在关系,来参与caspase-1调控骨瘤细胞增殖的过程。


使用TargetScan Human 5.1来查找和caspase-1之间存在碱基互补配对的miRNA,生物信息学预测显示:miR-214和caspase-1的3’UTR序列具有结合位点(Fig.4A);


miR-214和caspase-1的 3'UTR结合,观察到荧光素酶活性降低(Fig.4B-C);


继续进行miR-214功能缺失实验,转染miR-214模拟物后,caspase-1的mRNA和蛋白表达量显著降低;转染miR-214抑制剂组caspase-1水平显著增加(Fig.4D-E);


这些结果证实caspase-1是miR-214的直接靶标。

 


circ-0016347和miR-214之间的功能串扰(天王间要斗法了~)


文献表明,circRNAs会封闭miRNA以终止其对靶基因的调控。因此,作者使用公共数据库miRanda、PITARNAhybrid,筛选circ-0016347靶向的某些miRNA。


发现miR-214具有人钾离子电压门控通道亚家族H1(KCNH1)的结合位点,并且已知KCNH1参与骨肉瘤的增殖、侵袭。circ-0016347具有KCNH1相应的线性序列(Fig.5A);


为了进一步检验circ-0016347与miR-214,miR-214与caspase-1之间的关系:


分三组①对照组、②转染si-circRNA组、③ 转染si-circRNA+miR-214抑制剂组。然后,采用qRT-PCR、WB检测circ-0016347、miR-214和caspase-1表达。


在Saos-2和MG-63两个细胞系中,与阴性对照相比,si-circRNA转染组中miR-214的水平显着升高,miR-214抑制剂(AMO-214)组显著逆转了由si-circ-0016347引起的miR-214高表达(Fig.5B-C);


caspase-1蛋白表达水平与其mRNA表达水平一致(Fig.5D-E)。



Circ-0016347作为miR-214海绵,miR-214对circ-0016347也具有相似的作用。circ-0016347与caspase-1呈正相关,这个过程可被miR-214抑制剂逆转。


从整体上看,circ-0016347与miR-214负相关,间接影响了骨肉瘤细胞中caspase-1的表达。

 

PS:miRNA海绵(miRNA sponge)一种长期抑制miRNA基因的高效方法,好像一块海绵吸满了miRNA,使其无法与天然靶点结合,其本质是一条mRNA,3’-UTR区域包含若干miRNA靶定位点。


感兴趣的客官可从Nature Methods自行查阅,这里就不展开了。

 

文章整体来说,换汤不换药,实验都是常见的,主角换成了circ-RNA蹭热门。感兴趣的小大夫们赶紧蹭蹭试试吧~

 

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