一篇好的文章，应该是通过不断地假设迭代，找到突破口的。有时候就需要在研究的过程中，再阅读大量的相关文献。比如夏老师今天要讲的这篇，复旦大学的唐惠儒教授团队和上海交大叶幼琼研究员团队发在25.5分的Cell子刊Immunity上的文章，这篇文章讲的是巨噬细胞的代谢重编程，这个机制研究的过程就很有意思：
首先他们感兴趣的是巨噬细胞的胆固醇调节情况，所以用三种体内外模型，来模拟了TAM（肿瘤相关巨噬细胞）的极化，其实也就是模拟M2极化。然后在这三种模型中，分析胆固醇合成的相关酶的变化。结果发现胆固醇氧化酶CH25H在所有三组模型的巨噬细胞中均显著上调（其实这也就是米勒五法的求同求异法分析，通过这样三组不同的分析，来确定可能与巨噬细胞M2极化有关的胆固醇合成差异，不清楚米勒五法的，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《轻松的文献导读》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。对应于CH25H的表达增加，其产生的25HC（25-羟基胆固醇）的含量也在TME（肿瘤微环境中）得到了富集：
那么CH25H在巨噬细胞中的增多，是否和TAM对于肿瘤的抑制有一定的关联性呢？他们就分析了单细胞测序结果（下面的UMAP图，其实就是以不同的基因表达作为标签，对细胞进行了分簇，不清楚这些图的话，可以看看《列文虎克读文献》和《夏老师带你读文献》），发现高表达CH25H的巨噬细胞会导致患者的生存率降低，也就是将巨噬细胞的M2极化后产生的抑制与胆固醇的代谢结合在了一起。而高表达CH25H会在OXPHOS（氧化磷酸化）等通路上造成影响：
那么是什么诱导激活了CH25H的表达增加呢？巨噬细胞的M2极化，其实和细胞因子是有密切关系的。于是他们就尝试分析了IL4和IL13这样的对巨噬细胞M2极化有影响的细胞因子，对于CH25H的表达的影响，结果发现，低pH环境、TME（肿瘤微环境）中的乳酸以及IL4和IL13都能激活CH25H的表达。那么CH25H对于TAM的免疫抑制又有什么作用呢？IL是通过激活JAK-STAT信号通路影响下游的（不清楚JAK-STAT信号通路的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列，这个通路在巨噬细胞以及免疫相关的研究中真的十分常见了），他们就分析了一下敲除CH25H后，对于STAT6的磷酸化影响：
结果发现敲除CH25H后（这个其实是柯霍氏法则的验证，缺失CH25H后，来分析具体的功能变化，以此确定CH25H的功能，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》），IL4/IL13诱导的STAT6的磷酸化被抑制，同时STAT6调节的下游巨噬细胞的M2极化，也就是免疫抑制功能也被阻止了，这也就说明了CH25H在巨噬细胞M2极化过程中的重要性。巨噬细胞M2极化和M1极化的区别，其实也在于能量代谢，于是他们分析了一下缺失CH25H或25HC处理，会对巨噬细胞的能量代谢产生什么样的作用：
通过Seahorse实验（上图的耗氧率OCR图，这个在《信号通路是什么鬼？》系列的铜死亡的那几章里也都介绍过了，可以复习下），发现CH25H的缺失会抑制巨噬细胞的OXPHOS，同样敲除了CH25H也会影响巨噬细胞的线粒体稳定。在低葡萄糖情况下，AMPKα被激活来影响OXPHOS或线粒体生物发生，于是他们就迭代了假设，假设CH25H会通过AMPKα激活OXPHOS，通过敲除CH25H后补充25HC，验证了CH25H对于AMPKα的磷酸化影响。
AMPKα和STAT6其实都参与了TAMs的免疫抑制功能，于是他们假设AMPKα可能会调控STAT6的磷酸化（熟悉AMPK信号通路的话，应该知道AMPK复合体作为一个激酶，下游除了影响能量代谢，也会对很多其他蛋白进行磷酸化修饰，不记得的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列）。通过敲除AMPKα分析IL4/IL13对于STAT6的激活，他们发现这个磷酸化激活过程可能是依赖于AMPKα的。而CH25H的缺失也会影响IL4/IL13诱导后，AMPKα与STAT6的结合。而突变了STAT6的磷酸化位点，会使得AMPKα无法激活STAT6的磷酸化。也就是说，AMPKα通过促进STAT6的Ser564位点的磷酸化，激活STAT6：
那么CH25H和25H是怎么才能调控AMPKα的呢？然后这篇文章的重点来了，就是查阅文献，而mTORC1（mTOR复合体1，其实这个在自噬通路和mTOR信号通路中都是很经典的了，不清楚的话可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列复习下）会直接磷酸化AMPKα的Ser345和347位点，导致AMPKα的激活环上Thr172磷酸化降低，从而抑制AMPKα激活。而下面这篇Science上描述了一个这样的机制，GPR155（溶酶体定位蛋白）通过其TM1结构域结合胆固醇，导致GPR155构象变化并通过Rag GTP酶激活mTORC1：
而AMPKα正是在溶酶体上被募集和激活的，于是他们就假设，是否是25CH通过竞争性结合了GPR155-TM1，导致了无法在溶酶体上激活mTORC1，使得mTORC1无法抑制AMPKα，才引发了AMPKα的激活。通过定位，和25CH与GPR155-TM1的结合验证，以及mTORC1对于AMPKα的磷酸化影响，他们确定了溶酶体上积累的25HC，通过竞争性结合GPR155-TM1，使得mTORC1复合物无法行驶对AMPKa的磷酸化抑制，从而触发AMPKa激活：
那么抑制CH25H的话，在临床上能不能有应用性呢？通过小鼠的体内实验模型，敲除CH25H或与抗PD-1抗体连用，结果发现这样可以增强免疫治疗效果，也就是把原来免疫细胞含量较少并处于免疫抑制状态的冷肿瘤，变成激活免疫抑制的热肿瘤：
结果就是这样的一个示意图，高表达CH25H会产生大量的25CH并定位在溶酶体上，25CH与胆固醇竞争性结合GPR155-TM1结构域，导致GPR155-TM1无法通过Rag1 GTP酶激活mTORC1，从而使得AMPKα磷酸化并激活了STAT6，导致了免疫抑制：
这篇文章给我的感觉就是，通过了不断地其他文献中的研究结果的支持，提出了独到的假设。其实假设的过程应该说是比较大胆的，在没有其他证据支持的情况下，就能假设25CH通过竞争性结合GPR155-TM1结构域影响mTORC1，然后激活AMPKα。这一步假设的迭代，基本上就奠定了这篇文章机制研究成功了一半了，的确是一篇不错的文章。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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