第十一期CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术学习班
玮瑜主办 江苏.南京
2017年5月12-14日 周五-周日
(理论与实验相结合，请认准 南京大学模式动物研究所赵庆顺教授主讲)
会议大楼
培训现场
实验现场
学员反馈
“CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因定点编辑技术，越来越被研究者所关注。在赵庆顺教授理论结合实际、幽默接地气的授课方式下，为期两天半的培训轻松且充实，让我从对 CRISPR/Cas9技术的毫无所知，到对该技术原理及应用有了的全面认识；同时，结合开展的实验环节，掌握了 CRISPR 序列的设计，基因组编辑工具的制备及向细胞内递送的方法；熟悉了利用 CRISPR 技术在动植物中敲入和敲除的过程；了解了 CRISPR/Cas9脱靶问题解决方案。通过本次学习，受益匪浅！”
——学员留言
本期还是赵庆顺老师全程主讲，聘请专业技术人员指导完成基因组编辑基础实验。学员除在全面了解基因组编辑理论知识之外，均可在专业人员指导下，独立完成以 CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑研究的系列实验；参会人员更可提前准备好自己科研中遇到的问题，通过三天现场的 “讲座 + 实验 + 答疑”的学习和交流，有机会全面掌握 CRISPR/Cas9技术应用的方法及技巧；同时免费获得一份 CRISPR/Cas9三合一对照质粒（含 CMV 启动子驱动的人源化 Cas9表达构件、爪蛙 Ef1a启动子驱动的绿色荧光蛋白筛选标记表达构件、以及人 U6启动子驱动的靶向识别人 P53基因的 sgRNA 表达构件---含可用于制备 sgRNA 体外转录模板的 sgRNA 骨架模板）。
主讲老师简介
赵庆顺，1987年本科毕业于南京大学，获学士学位；1990年硕士研究生毕业于南京大学，获硕士学位； 2001年博士研究生毕业于普渡大学获博士学位。2001-2003年在杜克大学医学中心 Elwood Linney 教授指导下进行博士后训练。1990-1996，先后任南京大学助教和讲师；2003加入南京大学模式动物研究，任副教授，2006年晋升为教授，2007年聘为博导。
赵庆顺等教授在2016年9月15日的 Genome Biology 上发表了关于新 DNA 编辑工具——SGN 的文章。该工具与 CRISPR、TALEN、NgAgo 等工具相比，最大的特点就是不受靶序列的限制。文章指出，SGN 能特异性识别和捕获目标，来准确切割任何 DNA 序列。
日程安排
第一天上午9:00-12:00
第一讲、基因组靶向修饰技术简介
1、基因功能研究的分子遗传学技术简介
2、基于 NHEJ 修复的基因敲除和基于HR修复的基因敲入
3、ZFN 和 TALEN 技术
4、CRISPR/Cas9技术
第二讲、CRISPR 的设计
1、目标基因结构及功能的生物信息学分析
2、CRISPR 的设计原则
3、CRISPR 的在线设计（可自带可无线上网之笔记本电脑或手机）
4、靶向编辑基因的基因型确认及 CRISPR 的再设计
第一天下午13:00-17:00
第三讲、基因组编辑工具的制备及向细胞内的递送策略
1、基因组编辑工具之 DNA 表达元件的制备与递送策略
2、基因组编辑工具转录产物制备及递送策略
3、基因编辑工具RNP的制备与递送策略
实验（或技术细节答疑）一： CRISPR/Cas9 基因组编辑工具All-in-One表达质粒的构建（1）
1、CRISPR模板引物的准备
2、CRISPR模板的制备
3、退火CRISPR模板与线性化CRISPR/Cas9 All-in-One载体的重组
4、大肠杆菌的转化
5、携带基因组编辑工具的转化子的涂板培养
第二天上午9:00-12:00
第四讲、sgRNA活性验证
1、体外法
2、体内法
2.1 插入缺失（Indel）突变检测的基本策略
2.2 基于胚胎反应器的活性验证方法
2.3 基于细胞系的活性验证方法
实验（或技术细节答疑）二：CRISPR/Cas9 基因组编辑工具 All-in-One 表达质粒的构建（2）
基因组编辑工具之 CRISPR/Cas9 All-in-One重组子的快速验证法（PCR 法）
实验（或技术细节答疑）三：基因组编辑子等位基因的基因型鉴定
1、基因组DNA模板制备
2、目标基因的基因组DNA片段的PCR扩增
第二天下午13:00-17:00
第五讲、利用 CRISPR 技术创建基因组编辑人及动物细胞系
1、创建基因组编辑细胞系的基本过程
2、基因敲入的供体 DNA 的设计原则及基因敲入供体设计实例
3、表达 CRISPR 的All-in-One表达质粒（和供体）导入细胞系的方法
4、阳性细胞克隆筛选
5、靶向突变的基因型鉴定及基因组编辑细胞系的建立
6、敲入基因和敲除基因（无效等位基因）的确认
7、建立基因组编辑细胞系的优选策略
第六讲、利用 CRISPR 技术创建基因敲除或敲入动物
1、创建基因组编辑动物突变体的基本过程
2、sgRNA/Cas9 mRNA（和供体）共显微注射入受精卵中建立初建者
3、初建者体细胞携带靶向突变等位基因的确认
4、基因敲除/敲入动物（F1）的鉴定
5、基因敲除/敲入动物品系（F2）的建立
6、敲除/敲入基因的确认
7、建立基因敲除或敲入突变体动物的优选策略
