【前沿精粹 090】揭开循环肿瘤细胞在结直肠癌中的动态：从生物学到临床应用

引言

引言

• 循环肿瘤细胞（CTC）是一群从原发肿瘤脱落并促进向转移部位扩散的异质性癌症细胞，它们的半衰期为1-2.5小时，以单个细胞或细胞团形式存在于循环系统中，这被认为增强了其转移能力。

• CTC的存在与结直肠癌患者较短的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关，在侵袭性更强的疾病中CTC更为常见，使其成为监测癌症演变和评估治疗效果的重要工具。

• CTC在血液中的浓度极低，转移性患者每毫升血液中可能只有1-10个CTC，这使得分离步骤变得复杂。

• 从接近肿瘤的血管中采集的液体活检提高了捕获CTC的能力，因为从肿瘤引流静脉中采血显著增加了捕获肿瘤新鲜脱落CTC的可能性。

• CTC分离涉及三个不同的步骤：富集、检测和细胞表征。富集步骤基于生物学特征或物理属性来增加CTC浓度。检测步骤使用免疫细胞学、分子或功能测定法。表征可以在单细胞水平进行，涉及基因组、转录组、蛋白质组和分泌组水平。

• CTC标记物的多样性突显了不同癌症类型和患者内部CTC异质性。不同器官微环境可以影响检测到的CTC类型。这种异质性源于空间上不同的血液微环境和癌症阶段及治疗反应的时间变化。

• 上皮-间质转化（EMT）过程增强了CTC的转移潜力，提高了它们进入血液循环的能力。CTC在转移形成过程中的动态相互作用表明EMT和MET之间的复杂关系。

• 研究表明，结肠CTC表现出干细胞特性，这增强了它们的播散和转移潜力。CTC与血液和组织组分的相互作用，包括与不同类型细胞的聚集，对癌症存活和转移疾病的促进至关重要。例如，肿瘤细胞与血小板之间的双向相互作用对癌症进展至关重要，被认为具有增强的侵袭潜力。

• CTC在循环血液中面临多种压力，包括剪切应力、失去锚定以及与细胞因子和免疫细胞的相互作用。为了恢复细胞内稳态，CTC可能激活适应性应激反应途径，增加应激耐受性，并显著贡献于它们的表型异质性。

• CTC采用不同方式在不利条件下生存并避免免疫监视。肿瘤和相关细胞的分子谱表明，癌细胞可以发展出类似免疫细胞的表型，表达如PDL1、CD47和CD14等免疫抗原以实现免疫抵抗。

• CTC发展出逃避抗肿瘤免疫反应和制造受损微环境的机制，涉及与多种血液组分的相互作用，如中性粒细胞、巨噬细胞、血小板、骨髓源抑制细胞（MDSC）和癌相关成纤维细胞（CAF），以逃避免疫系统并促进生存。

• 中性粒细胞与癌症进展相关，数量增加与预后不良相关。CTC增加免疫抑制趋化因子如CCL5和CXCL5的表达，这些趋化因子招募调节性T细胞（Treg）和中性粒细胞，抑制抗肿瘤免疫反应。

• CTC-中性粒细胞簇中的中性粒细胞表达粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和其他细胞因子，刺激中性粒细胞招募。中性粒细胞可以直接通过如Mac-1/ICAM-1或VCAM1依赖的细胞间连接以及与IL-1β和IL-6的细胞因子-受体串话，促进CTC的外渗和增殖。

• 中性粒细胞外陷阱（NET）可以在循环中捕获CTC，促进转移扩散。NET通过创建物理网状结构在血液中固定CTC，并通过涉及一系列细胞粘附蛋白如钙粘蛋白、整合素和表面糖蛋白的相互作用促进粘附。NET可以通过抑制外周白细胞、自然杀伤（NK）细胞和效应T细胞的激活来抑制免疫监视。

• CTC与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）之间的相互作用在转移的各个阶段中起着关键作用。CTC可以诱导单核细胞分化为TAM，导致分泌促进白细胞招募、迁移和侵袭的介质。

• 在结直肠癌中，TAM与癌细胞之间的反馈循环对CTC的EMT程序和它们进入血液循环至关重要。TAM有助于CTC的机械粘附性、耐受力和保护性细胞团的形成，赋予其对剪切应力的抵抗力。

• 已在结直肠癌患者的血液中鉴定出表达M2样巨噬细胞表型和上皮标记物的巨噬细胞-肿瘤细胞杂交体。当这些杂交体重新移植到小鼠体内时，它们广泛扩散并在远端组织中形成病变，与疾病阶段和总生存期相关。

• CTC与血小板之间的相互作用显著影响癌症转移和进展；涉及多种受体和配体，并影响外渗和转移等过程。血小板通过CTC表达的促血栓微颗粒或组织因子与CTC形成团簇。

• 血小板保护CTC免受机械应力，诱导对anoikis的抵抗力，并通过多种机制阻碍NK细胞攻击。血小板释放的细胞外囊泡（EV）加速EMT过程，促进侵袭和转移。血小板也在CTC粘附至内皮细胞和增加血管通透性中发挥作用，促进肿瘤细胞的跨内皮迁移。

• MDSC是具有免疫抑制特性的髓系细胞群，它们促进癌症的转移扩散。CTC与MDSC形成的簇被认为可以逃避T细胞免疫监视。

• CAF在肿瘤微环境中丰富，并在肿瘤启动、血管生成、转移和药物抗性中发挥关键作用。CAF可以与循环中的CTC形成复合体，促进播散和侵袭。

• CAF在复合体中为CTC提供支持性微环境，促进它们的生存并保护它们免受免疫监视和凋亡。CAF还为CTC在播散期间提供保护，以抵抗流体剪切力。

• 肿瘤通常激活免疫检查点途径以抵抗抗肿瘤免疫反应。免疫检查点分子如PDL1、CTLA-4和CD47被识别为肿瘤免疫逃逸的关键因素，有助于肿瘤生长和转移。

• CTC的预测价值因不同肿瘤阶段而异，表明CTC的先天免疫和获得性免疫逃逸机制与其转移潜力之间的相关性。肿瘤组织和CTC中PD-L1表达的差异突出了评估外周和局部免疫以获得全面洞察的重要性。

• KRAS、p53和CTLA-4的表达失调促成了肿瘤与免疫系统的相互作用，并可能影响免疫检查点分子的表达。例如，p53功能的丧失增强了PD-L1的表面表达，导致T细胞失活。

• 液体活检的特点是可以让患者直接在家中采集所需的血液样本。这种方法比组织活检分析提供更快的结果，并且可以帮助检测和基因分型那些没有可获取的组织癌症样本的患者体内的隐藏恶性肿瘤。

• 尽管组织活检仍然是癌症诊断和生物标志物评估的主要方法，液体活检已被广泛使用。液体活检提供了一种非侵入性和可重复的方法来分析癌症基因型并随时间监测患者。

• 可以在血样中识别和表征各种循环生物标志物，无论是在血浆还是血清中，如肿瘤衍生的外泌体或外囊泡、蛋白质、循环游离RNA（cfRNA）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和肿瘤教育血小板（TEP）。

• 在细胞分数中可以识别单个CTC和CTC团簇、循环内皮细胞（CEC）和CAF。CTC在血液中的浓度非常低，通常只在10%-30%的早期癌症患者中发现，这使得它们的分离和分析变得复杂、昂贵和技术复杂。

• CTC的检测通常缺乏一致性，引发了对CTC标记物可靠性的担忧，并对其特异性产生了怀疑。这种低检出率进一步受到肿瘤细胞流入血液中时首先遇到的器官迅速捕获的影响。

• CTC分离需要包括富集、检测和细胞表征等步骤。研究人员使用先进技术、各种平台和测定法通过细胞大小识别或细胞表面抗原表达来进行CTC分析。

• 富集是CTC测定的第一步，它增加了CTC的浓度，使得检测单个肿瘤细胞变得更容易。这一步骤可以基于生物学特性，如蛋白标记物，或物理特性，如大小、密度、可变形性或电荷密度。

• 基于物理特性的几种方法被用来分离CTC。密度梯度离心涉及基于在不同密度介质中的迁移通过离心力分离血液成分。

• 磁激活细胞分选（MACS）使用附着在抗体上的磁性纳米颗粒来捕获细胞。另一种负向CTC选择策略涉及红细胞溶解和白细胞的磁性耗竭，提高了独立于CTC表型的活力。

• 微过滤方法使用微尺度收缩来按大小或可变形性捕获细胞，允许快速富集，但存在异质性、膜堵塞和恢复问题等缺点。微流体操纵小流体体积，根据大小、可变形性或团簇结构分离CTC。然而，异质性导致CTC丢失和白细胞污染。

• 介电特性在ApoStream™和DEPArray™中被利用，使用介电泳力进行分离，提供单细胞恢复和活力，但面临样本量低和细胞属性随时间变化的限制。

• 富集后，识别步骤至关重要，以在周围的白细胞中检测CTC。这是通过各种免疫细胞学、分子或功能测定法实现的。免疫亲和性基础方法使用抗体与细胞上的特定目标抗原之间的亲和反应，实现高恢复率和纯度。

• 基于核酸的方法可以检测CTC。在DNA或mRNA水平上识别CTC涉及创建针对组织、器官或肿瘤的特定转录本的PCR测定法，或检测特定于肿瘤的独特遗传改变，如突变、易位或甲基化模式。分离后，细胞可以进行后续分析。分子表征提供了有关其起源、扩散能力、药物敏感性或抗性和转录可塑性的至关重要的信息。

图3. 在临床和研究环境中，使用各种方法来富集、检测和表征CTC。基于物理特性的方法包括基于大小的过滤、密度梯度离心、介电泳和微流控芯片，每种方法都利用独特的物理特性，如大小和电特性来分离CTC。在基于免疫亲和性的方法中，使用磁性颗粒进行正向选择，使用特定抗体或进行负向选择以去除不需要的细胞，提高CTC的纯度；微流控芯片也可以采用这些选择策略中的一种。富集后，通过各种方法识别分离的CTC，包括免疫细胞学、分子或功能测定法。免疫细胞学方法涉及使用针对特定细胞标记的抗体对CTC进行染色。分子方法侧重于通过基于核酸的测定法识别CTC。功能测定法允许基于CTC的生物活性检测活的CTC，例如测定CTC分泌的特定蛋白质。表征技术，如通过CTC培养进行的功能分析和包括基因组学和蛋白质组学的单细胞分析，用于评估分离的CTC的生物学和功能特性。

• 结直肠癌的肿瘤异质性在临床应用分子预后标志物方面存在重大挑战，导致药物抗性，限制了组织学诊断的精确性，并阻碍了许多肿瘤疗法的有效性。CTC作为一种替代癌症诊断的方法，能更准确地监测肿瘤生物学的动态变化。

• CTC的异质性可以反映治疗干预的选择性压力，监测CTC中的生物标志物变化可能揭示肿瘤进化的见解，并帮助识别对个体患者有效的药物，特别是那些具有或发展出治疗抗性的患者。

• CTC在结直肠癌中作为检测肿瘤、预测结果、监测治疗和定制治疗的生物标志物具有很大潜力。然而，由于检测和可复制性的挑战，CTC分析在结直肠癌中的应用仍然有限。

• 肿瘤的范围和治疗后的残留状态是结直肠癌结果的关键预测因子，CTC的检测可以帮助早期识别潜在的转移，并选择可能从替代治疗方案中受益的化疗抗性患者。

• 治疗前后的CTC计数可以预测无进展生存期和总生存期，提供超出影像学方法的宝贵预后信息。CTC可以评估结直肠癌患者的化疗效果和预后，识别CTC可以预测III期结肠癌患者的结果，突出对标准治疗的潜在抗性。

• 研究揭示了CTC中基因表达与癌症的临床病理特征之间的显著相关性。癌胚抗原（CEA）水平可以预测肿瘤侵袭、隐匿性转移风险和复发率。KRAS基因突变与结直肠癌患者的复发和死亡风险增加相关，并且导致对EGFR抑制剂的抗性。

• 携带野生型KRAS的CTC在接受治疗的患者中显示出更长的无进展生存期和总生存期，突出了它们在治疗反应预测中的价值。单细胞水平的转录组分析进一步提高了对肿瘤内异质性和治疗反应预测的理解。

• CTC中的基因表达谱，如LGR5表达，已与结直肠癌患者的转移和预后不良相关联。CTC中的多基因表达面板可以预测治疗反应并识别可能从特定疗法中受益的患者，允许及时调整治疗计划。

• CTC在外周血液中表达的癌基因ECT2比血清CEA水平更敏感，特别是在晚期结直肠癌患者中，其在CTC表面的表达被认为是结直肠癌的潜在预后标志物。

• 不同基因的表达也用于监测CRC患者的疾病进展和预测结果。利用CTC的下一代测序（NGS）使得能够进行高通量分子诊断，帮助理解免疫逃逸机制和药物抗性，并在癌症中识别新的信号通路。

• 特别是，在CTC的各种表型中检测特定染色体变异和标记物如COX-2的表达，揭示了COX-2表达在间充质CTC与转移之间的密切关联。

• 利用细胞系和异种移植模型的功能性CTC分析已经识别出潜在的治疗靶点，如PI3K/AKT/mTOR信号通路。VEGF的过度表达预测复发，EGFR的表达影响治疗反应。

• 免疫细胞化学、免疫组织化学和RTPCR是CTC检测常用的技术，尽管标准化技术和结果冲突仍需改进以供临床常规实施。先进的检测方法，如比色膜阵列和加权酶芯片阵列（WEnCA），有望提高结直肠癌患者早期诊断和术后监测的灵敏度和准确性。