细胞焦亡（Pyroptosis）是一种由Gasdermin家族蛋白介导的炎症性细胞死亡【1】。当细菌、病毒等病原体引发胞内感染时，炎症小体信号通路会被激活，caspase-1及caspase-4/-11酶切活化成孔蛋白Gasdermin (GSDM) D，释放其N端结构域，GSDMD N-端结构域在细胞膜上寡聚形成孔状复合物，引起细胞破裂，导致细胞焦亡发生并释放白细胞介素（IL）-1β、IL-18以及损伤相关分子模式（DAMPs），进而诱发强烈的炎症反应【2,3】。细胞焦亡作为一种关键的效应反应，正逐渐被认为在健康与疾病中扮演着重要角色。在炎症小体反应中，IL-1β和IL-18已被广泛研究；但除白介素（IL）-1细胞因子和DAMPs外，炎症反应如何调控仍不明确。适度的细胞焦亡有助于宿主天然免疫防御和肿瘤免疫，而过度的细胞焦亡则会引发不必要的炎症，可能会导致致命后果。此外，那些不具有炎症小体介导的病原体感知能力细胞发生广泛死亡，与脓毒症中的免疫病理学密切相关【3,4】。然而，这类旁观者细胞死亡的潜在机制仍然在很大程度上未知；同时，细胞焦亡在疾病发病机制中的全面影响也尚未被充分理解。2024年12月31日，康涅狄格大学健康中心免疫系Vijay A. Rathinam研究小组在Cell杂志上发表文章 Transplantation of gasdermin pores by extracellular vesicles propagates pyroptosis to bystander cells。本研究揭示了细胞焦亡从焦亡裂解细胞传播至旁观细胞的细胞间传播机制，发现这一传播过程是由焦亡细胞释放的细胞外囊泡（EVs）携带焦亡执行分子GSDMD孔并转移至旁观细胞的细胞质膜介导完成的，并且诱发这些旁观细胞发生焦亡性死亡。首先，研究者探讨了细胞焦亡是否能够传播到旁观细胞。研究中观察到，将CD45.1+野生型（WT）骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和CD45.2+ Nlrp3-/- BMDMs进行共培养，在加入尼格霉素（NLRP3激活剂）进行刺激后，后者也经历了细胞死亡，由于Nlrp3-/- BMDMs对尼格霉素（NLRP3激活剂）诱导的细胞焦亡具有抗性，从而表明它们的死亡并非尼格霉素的直接作用，而是由CD45.1+ WT BMDMs在尼格霉素诱导下发生细胞焦亡所引起的旁观细胞死亡。同样的，在Gsdmd-/- iBMDMs中，引入可诱导性表达GSDMD-NT的质粒（iBMDM-iGSDMD-NT细胞），再与不包含该质粒的细胞（iBMDMs-WT）进行共同培养，当GSDMD-NT被诱导表达时，首先观察到iBMDM-iGSDMD-NT细胞焦亡的发生，随后旁观的WT BMDMs细胞也发生焦亡性死亡，提示了细胞焦亡向旁观细胞的传播。这一过程在小鼠体内中也同样被观察到。作者建立了三种小鼠体内研究模型，包括1）将表达AF647标记LPS的大肠杆菌腹腔注射感染WT小鼠，并评估未感染的腹腔细胞（即旁观细胞）中的细胞死亡；2）将CellBrite488标记的iBMDM-iGSDMD-NT细胞（Dox可诱导表达GSDMD-NT）转移到WT小鼠的腹腔中，并评估CellBrite488阴性腹腔细胞（即旁观细胞）的细胞死亡；3）将FITC-LPS电穿孔处理的CD45.1+ WT BMDMs转移到同基因型的CD45.2+ Gsdmd-/-小鼠的腹腔后（图S1D），评估Gsdmd-/-小鼠的CD45.2+腹腔细胞细胞死亡。所有的模型中，都观察到了在目的细胞被诱发焦亡发生后，小鼠体内的旁观细胞也随后发生细胞死亡。综合表明，细胞焦亡在体内的许多细胞类型中都能引发旁观细胞死亡。通过使用跨隔孔培养板，将发生焦亡细胞和旁观细胞分隔开培养，旁观细胞依旧会发生死亡；此外，焦亡细胞的培养上清液同样具备诱发旁观细胞焦亡的能力，这些提示细胞焦亡通过分泌因子以接触无关的方式在细胞间传播。为了进一步识别在细胞焦亡上清液中诱导细胞死亡的因子，研究者利用凝胶排组色谱对焦亡细胞上清液进行分离，最终发现具备细胞裂解活性的组分。通过电子显微镜观察到该组分包含细胞外囊泡（EVs）。进一步的超速离心分离及生化验证，确认这些分离出来组分的确是典型的EVs，并且这些EVs能够诱发旁观WT BMDMs发生细胞裂解死亡。随后的细胞和小鼠模型实验都进一步表明了，从焦亡细胞上清液分离出来的细胞外囊泡促使旁观细胞死亡。焦亡细胞分泌的囊泡如何传播细胞焦亡，一种可能性是焦亡囊泡相关DAMPs（损伤相关分子模式）通过激活受体细胞的炎症小体来引发死亡，而这个过程中旁观细胞需要包含GSDMD才能够发生。但来自Dox刺激的iBMDM-iGSDMD-NT细胞的外泌体也能诱导Gsdmd-/- BMDMs发生细胞裂解死亡，从而表明焦亡细胞囊泡的活性并不是通过激活炎症小体的DAMPs来实现的，也不依赖于旁观细胞的炎症小体机制。另一种可能性是焦亡细胞囊泡通过携带活化的GSDMD并将其传递给受体旁观细胞，从而通过细胞外机制引发细胞裂解。免疫印迹检测及流式分析发现，焦亡细胞分泌的囊泡中包含明显的GSDMD- NT- BFP蛋白及其信号。通过免疫金标记结合电子显微镜成像，发现这些GSDMD-NT位于焦亡细胞分离出来的囊泡上。进一步生化和细胞分析表明，焦亡细胞囊泡处理过的旁观细胞上能够分离检测GSDMD-NT-BFP并且这些GSDMD-NT位于旁观细胞膜上。从而表明焦亡细胞囊泡将GSDMD-NT转移到旁观细胞并引发其死亡。GSDMD以孔状形式存在于焦亡性囊泡并介导旁观细胞死亡GSDMD-NT是以何种形式存在于焦亡性囊泡上呢？DSS交联后免疫印迹发现，这些囊泡包含GSDMD的为寡聚化状态。为了精确确定GSDMD在囊泡上的结构构象，研究者对iBMDM-iGSDMD-NT 囊泡进行了抗tagBFP纳米抗体DNA锚定链（tagBFPnb-DS）染色，并使用DNA-PAINT超分辨率显微镜进行分析。观察到这些囊泡中GSDMD-NT的呈弧形和环形结构，这与细胞焦亡发生过程中细胞膜上的GSDMD结构的形状和大小相似。此外，利用去垢剂提取的策略，也能够在这些囊泡中提取到GSDMD孔状复合物。这些结果表明，GSDMD以孔的形式存在于焦亡细胞释放的囊泡中。综合考虑焦亡囊泡上GSDMD孔，GSDMD在焦亡囊泡处理的旁观细胞膜上的定位，以及囊泡与旁观细胞的融合能力，研究者提出了焦亡细胞囊泡携带GSDMD孔转移至旁观细胞膜上，最终导致旁观细胞死亡。为了探究这一点，研究者利用脂质体泄漏实验体系进行研究。将来自Dox诱导的iBMDM-iGSDMD-NT和iBMDM-iGSDMD-FL细胞的EV与包裹有6-氨基荧光素（6-FAM）染料的脂质体混合，并监测荧光染料的释放。来自Dox诱导的iBMDM-iGSDMD-NT焦亡细胞的囊泡导致脂质体泄漏。二硫仑可共价修GSDMD-NT的Cys192并阻止GSDMD-NT单体在膜上的插入和组装，但不影响已存在GSDMD孔。在我们实验中，二硫仑并未抑制GSDMD-NT 囊泡诱导的脂质体泄漏，这表明GSDMD-NT孔已经存在于囊泡上，并通过孔的形式转移至旁观细胞，诱发其焦亡死亡。综上所述，这项研究拓展了细胞发生焦亡的影响，展示了携带GSDMD孔道的焦亡细胞外囊泡（EVs）能够将GSDMD孔道移植到邻近细胞表面，从而将细胞死亡传播至旁观细胞。揭示了一种支配疾病相关旁观细胞死亡的类似多米诺效应的机制。康涅狄格大学健康中心免疫系Vijay A. Rathinam教授为本文的通讯作者，Skylar S. Wright和Puja Kumari博士为论文的共同第一作者，该系阮建彬教授及课题组成员汪成亮博士以及德国奥斯纳布鲁克大学Katia Cosentino教授也作为主要贡献人参与了该课题研究。https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01334-5制版人：十一
1. Broz, P., Pelegrin, P. & Shao, F. The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation. Nat Rev Immunol 20, 143-157, doi:10.1038/s41577-019-0228-2 (2020).
2. Shi, J., Zhao, Y., Wang, K., Shi, X., Wang, Y., Huang, H., Zhuang, Y., Cai,T., Wang, F., and Shao, F. (2015). Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature 526, 660–665.
3. Wu, C., Lu, W., Zhang, Y., Zhang, G., Shi, X., Hisada, Y., Grover, S.P., Zhang, X., Li, L., Xiang, B., et al. (2019). Inflammasome Activation Triggers Blood Clotting and Host Death through Pyroptosis. Immunity 50, 1401-1411.e4.
4. Hotchkiss, R.S., Monneret, G., and Payen, D. (2013). Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nat. Rev. Immunol. 13, 862–874.
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