为什么要测单细胞？单细胞测序产生背景及应用前景！

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熟悉师兄公众号的都应该清楚，师兄之前的推文主要集中在各种类型的科研绘图上！但是不少粉丝小伙伴们还是反应，只知道绘图，数据不会分析，还是不行的呀！没错，拿不到可靠的分析结果，只知道绘图，这当然是远远不够的！因此， 学习各种常用的生信数据分析则必然成为了每一个生信人必须要经历的事情。 因此，后续的推文中，师兄会尽可能地多更新一些有关数据分析的内容，可能包含的系列包括《R语言数据处理基本技巧》、《从零开始学单细胞转录组》、《从零开始学空间转录组》等；

本系列，师兄将 从单细胞转录组学开始 ，带领大家一起 从零开始学单细胞 ！系列内容可以详见下方大纲！

说明： 由于本系列教程还是强调 面对完全零基础小白 ，所以很多内容师兄会介绍的非常细，对于部分已经入门的老手来说可能比较多余，所以 大家选择性阅读即可！

本系列主要内容目录，请看Part 1；

本期主要内容，请看Part 2；

本系列配套《生信师兄单细胞学习交流群》详情，请看Part 3；

合作服务器推荐及生信师兄粉丝专属优惠详情，请看Part 4；

Part 1 系列介绍

1.1 系列简介

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本系列一共包含3个主要章节，其中：

• 第一章：认识了解单细胞转录组 ，在本章中，师兄会详细介绍单细胞测序的产生背景、应用前景，以及单细胞测序技术的基本原理、质控标准以及上游分析流程！
• 第二章：常用的单细胞转录组学分析 ，单细胞转录组学的分析内容非常广泛，从基础的细胞聚类分群、差异富集，再到细胞通讯、CNV、轨迹分析、RNA velocity、转录因子等高级分析；其中的每一种分析都需要深入理解底层逻辑才能更好地使用它们，很多时候，只是复制粘贴别人的代码，套到自己的数据上却得到了完全错误的结果，这很可能就是因为你并没有理解每一步在干嘛？为啥这么干？因此，本章会从每一种分析的背景、逻辑、算法原理、代码实操等多个维度对其进行详尽地阐述。以帮助各位小伙伴能够准确无误地使用本系列代码！
• 第三章：单细胞文献精讲与主图复现 ，这部分师兄会通过一篇CNS级单细胞转录组学文献的主图复现，带着大家将前面所学到的知识更好地应用在实际课题当中！实现真正的学以致用！

以上就是本系列教程的内容简介，需要指出的是， 目前，师兄还没有太多的时间抽出来录课 ，因此暂时只是整理了 本系列全部分析过程的笔记和代码，以及所有示例数据！ 但是，我相信通过详尽地笔记教学及交流群的充分讨论，大部分同学还是能够轻松入门的！当然，如果后续有时间和精力，并且各位小伙伴迫切需要的话，师兄也会尽可能抽时间来录课！ 届时入群的小伙伴只需补购课差价即可！

1.2 内容大纲

Part 2 了解单细胞测序的世界

2.1 为什么需要单细胞RNA测序

人类各种组织之间细胞的类型，状态和相互作用差异巨大。而单细胞RNA测序（snRNA-seq）技术提供了在单细胞水平观测基因表达的方法，可以更好地研究这些组织及其中存在的不同类型的细胞。

这一尖端且激动人心的技术可被用于：

• 研究一个组织中到底存在哪些种类的细胞
• 识别未知或少见的细胞类型或状态
• 阐明在分化过程或时间及状态变化中基因表达的改变
• 找出在不同条件下（如加药组和疾病组）在某一特定类型的细胞中差异表达的基因
• 探究一种细胞类型之间基因表达的变化，同时纳入空间，调控和/或蛋白质信息

单细胞测序中解决一些较常见问题的方法包括：

• 探究异质性 (Studying heterogeneity)
• 谱系路径分析 (Lineage tracing study)
• 随机基因表达研究 (Stochastic gene expression study)

2.2 单细胞RNA测序分析中面临的挑战

尽管单细胞RNA测序能够获得在细胞水平上的基因表达，但样本制备和建库成本更高，分析也更复杂，更难解读。单细胞RNA测序分析的复杂性包括：

2.2.1 数据量巨大

单细胞RNA测序项目的表达量数据代表了成千上万个细胞中上万或数十万条读取 (reads)，产生的数据要大得多，需要更多的内存来分析，更大的硬盘来存储，以及更多的时间来运行分析。

2.2.2 每个细胞测序深度低

对于基于油滴（droplet）的单细胞RNA测序方法，测序的深度较浅，通常每个细胞只能检测到10-50%的转录组。这导致细胞中许多基因显示为零计数。然而，在一个特定的细胞中，一个基因的零计数可能意味着该基因没有被表达，或者只是没有检测到转录本。在细胞中，表达水平较高的基因往往具有较少的零计数。由于这一特性，许多基因在任何细胞中都不会被检测到，细胞间的基因表达也会有很大的差异。

2.2.3 跨细胞/样本的生物学误差

我们不感兴趣的生物学变异会导致细胞间的基因表达跟实际的生物细胞类型或状态更为相似或不同，从而影响细胞类型的识别。这些生物学变异（除非是实验研究的一部分）包括：

• 转录脉冲 (Transcriptional Bursting) ：并非所有基因的基因转录都处于开启状态。捕获时间点将决定每个细胞中的基因是打开还是关闭状态。
• **RNA加工的不同速度 (Varying rates of RNA processing) ** ：不同的RNA以不同的速率进行加工。
• 连续或离散的细胞特征 (Continuous or discrete cell identities) ：例如单个T细胞的促炎症潜能。连续的表型通过基因表达上的变化来定义，有时很难区分表型是连续的，还是离散的。
• 环境刺激 (Environmental stimuli) ：细胞的周边环境可以通过空间位置、信号分子等方式影响基因的表达。
• 时序改变 (Temporal changes) ：基本的细胞时序变化过程，例如细胞周期，可以影响单个细胞的基因表达谱。

2.2.4 跨细胞/样本的技术性误差

技术来源的变异会导致细胞间的基因表达因技术来源而变得更相似/不同，而不是细胞类型/状态，这会影响细胞类型的识别。技术来源的变异包括：

• 不同细胞的捕获效率 (Cell-specific capture efficiency) ：不同细胞捕获的转录本数量不同，导致测序深度不同（例如，转录组的10-50%）。
• 文库质量 (Library quality) ：降解的RNA、低活性/濒死的细胞、大量游离的RNA、分离不好的细胞以及细胞定量不准确都会导致测序质量过低。
• 扩增偏差 (Amplification bias) ：在建库（library preparation）的扩增步骤中，并非所有的转录本都被扩增到相同的水平。
• 批次差异 (Batch effects) ：批次问题是单细胞RNA分析中的一个重要问题，因此你可以看到由于批次问题而导致的基因表达上的显著差异。

2.3 总结

虽然单细胞RNA测序是一种强大而深刻的从单细胞水平分析基因表达的方法，但由于存在许多挑战和变异因素，单细胞转录组的数据分析显得复杂且受限。

综上所述，我们提出以下建议：

• 除非对解决我们感兴趣的科学问题有必要，否则不要进行单细胞RNA测序。你是否能够使用更简单，更廉价的批量RNA测序解决你的科学问题？也许可以使用流式细胞仪（FACS）对样本进行分选，以便进行批量分析？

• 了解你想解决的科学问题的各种细节。推荐的建库方法和分析流程可以根据具体实验而有所不同。

• 尽可能地避免技术来源的差异：

• 实验开始前与专家讨论实验设计

• 同时从样品中提取RNA

• 同时建库或替换样本组以避免批次混淆

• 不要混淆不同性别、年龄和批次的样本组

2.4 参考文档

• https://github.com/hbctraining/scRNA-seq/blob/master/lessons/01_intro_to_scRNA-seq.md
• https://zhuanlan.zhihu.com/p/134081373

Part 3 生信师兄单细胞学习交流群

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当然了，好的学习过程离不开详尽地交流讨论和重难点答疑！因此，在发布教程的同时，师兄也成立了 《生信师兄单细胞学习交流群》 用于本系列内容的学习交流。需要的小伙伴可以扫描下方二维码，添加师兄微信后备注 “单细胞学习交流群” 后付费加群！

3.1 群内资源：

• 本系列所有免费及付费内容的配套学习资源、代码资源及示例数据；

• 师兄会在群内提供不定时答疑，满足答疑要求的问题师兄会尽可能抽时间回答；

3.2 答疑要求及入群费用

关于答疑，这里先提几点要求：

• 不在要求范围的问题，不做解答（丑话说在前面！！！）；

• 代码报错： 如果是 师兄提供的系列代码和示例数据的报错，答疑完全覆盖，保证你能完整跑通代码 ；但是 如果是你自己的数据，师兄只能尽可能答疑，不保证有问必答 ，因为每个人的数据和代码都五花八门，如果逐个解决着实是忙不过来；

• 背景知识理解及代码理解： 这里首先强调下研究生阶段自主学习能力的培养，如果 在你进行了能力范围内地思考、搜索，仍然无法解决，师兄会在答疑时间内尽师兄的能力答疑 （因为师兄也不能保证啥都会，有些算法的细节，你来问我，我可能也需要细看文献才能理解！）

• 提问要求： 如果想要得到更好地答疑，首先需要 确保你描述清楚了问题 ，很多人就发个报错信息，你的代码背景是啥？数据是啥？都不提供！这种只能说爱莫能助了！因此， 提问前尽可能整理好解决这个问题可能需要的其他材料 ，尽可能让答疑者详尽地理解你的问题，从而实现更好地解答！

• 群内自由交流讨论： 群内随时都可以自由交流讨论， 三人行必有我师 ！因此，多交流，多帮助！ 帮助他人的过程，也是提升自己的过程！

入群费用

• 入群费用： ¥299元（每集赞1个抵扣1元，至多抵扣100元！此优惠永久有效！）

视频教程

• 目前，师兄还没有足够的时间进行视频课程的录制，所以 本系列教程不包含视频课程 ！但是如果大家需要，师兄也一定会尽可能抽时间录制课程！

• 如果后续推出视频课程 ，还是和《R语言科研绘图进阶版视频教程》一样， 加群的小伙伴届时可凭借入群截图，抵扣购课差价。 所以，早入群早享受吧！

3.3 声明

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• 是否加群，纯属自愿！ 本系列的大部分内容会是免费阅读， 所以完全支持白嫖！ 但是看完还请动动你的手指， 点个赞！点个在看！如果能转发那就太感谢了！