Cancer Cell（IF48.8）：南开大曹雪涛院士团队揭示CD28在乳腺癌中的免疫调控作用

Cancer Cell 上发表的新文章通过在三阴性乳腺癌小鼠模型中进行体内全基因组 CRISPR 功能丧失筛选，发现抑制 CD28 能够降低 PD-L1 的表达，增强抗肿瘤免疫反应，并克服抗 PD-1 耐药性，为改善乳腺癌提供了新的免疫治疗策略。

数据来源： 从医院和肿瘤研究所获取原发性乳腺癌、肺癌样本以及接受创伤性脾切除术的健康供体的脾细胞；购买6-8周龄雌性 BALB/c 、 BALB/c 裸鼠和 NOD/SCID 小鼠并做不同处理；从 ATCC 、北京协和医学院细胞资源中心等处获取数十种肿瘤细胞系。

CRISPR 筛选： 利用体内 CRISPR-Cas9 基因编辑技术在小鼠三阴性乳腺癌模型中进行全基因组失活筛选，以鉴定影响免疫逃逸的关键基因。

基因敲除： 构建 Cd28 基因敲除的乳腺癌细胞系，以研究 CD28 缺失对肿瘤生长和免疫反应的影响。

免疫细胞分析： 使用流式细胞术、免疫荧光和多重免疫荧光染色等技术检测肿瘤微环境中免疫细胞的浸润和活化状态。

单细胞测序分析： 使用 Cell Ranger 和 Seurat 包处理 scRNA-seq 数据，分析肿瘤微环境中不同免疫细胞的组成和功能变化。

质谱分析： 利用 CyTOF 技术深入分析免疫细胞的表型和功能。

RNA-蛋白相互作用： 通过 RNA 免疫沉淀（ RIP ）和 iCLIP 技术分析 CD28 与 CD274 mRN A的直接相互作用，以及 CD28 如何调控 PD-L1 的表达。

体内全基因组 CRISPR 筛选确定癌细胞 Cd28 是肿瘤持续生长和免疫逃逸的关键

为鉴定 TNBC 中决定免疫逃逸或抗肿瘤免疫力的关键基因，研究使用体内全基因组 CRISPR-Cas9 功能筛选技术将 mGeCKOv2 转导到乳腺癌细胞中并接种到小鼠模型中（图1A）。 sgRNA 测序显示，转导靶向 sgRNA （4T1-sgRNAs）肿瘤在20天内被消除，而对照组正常生长（图1B）。 单细胞测序揭示这些肿瘤中富含树突状细胞（ DC ）和T细胞，其中 cDC1 和 CD8+T 细胞的富集可能是肿瘤根除的原因 。随后，研究利用 CRISPR 筛选确定 CD28 为关键基因，其敲除可以完全消除肿瘤（图1C）。 CD28 在癌细胞的细胞质和细胞核中高表达，并且其赖氨酸乙酰化可能促使其从质膜易位到细胞核和细胞质（图1D-J）。

图1

癌细胞中 CD28 胞内结构域的缺陷会在体内诱导抗肿瘤 CD8+T 细胞反应

通过生成 Cd28 敲除的乳腺癌细胞株，研究发现 Cd28 敲除可以完全抑制 4T1 肿瘤生长，使小鼠长期存活（图2A-E）。然而， Cd2 8敲除对免疫缺陷小鼠的肿瘤生长几乎没有影响，表明宿主免疫系统的依赖性（图2F，G）。此外，小鼠免疫系统清除 Cd28 KO 4T1 细胞后，对再次接种的的 4T1 和 4T07 细胞（来自410.4乳腺癌细胞）具有抗性，但对于 CT26 结肠癌细胞没有抗性（图2H-J）。研究还发现 CD8+T 细胞在抗肿瘤中起作用，而非 CD4+T 细胞（图2K）。 CD28 蛋白结构和定位实验表明其通过胞内区域介导了肿瘤的免疫逃逸 （图2L-O）。

图2

接种 Cd28 缺失癌细胞重编程 TME ，富集 cDC1 并诱导抗肿瘤 CD8+T 细胞免疫

研究通过流式细胞术和 CyTOF 分析了 Cd28 KO 乳腺癌肿瘤中的免疫细胞浸润。结果显示， Cd28 KO 肿瘤中 cDC1、CD4+T 和 CD8+T 细胞的浸润显著增加（图3A-D）。 IFNγ+CD8+T 细胞和 PRF+GZMB+CD8+T 细胞的频率也增加，表明T细胞的活化和细胞毒性功能增强（图3E-F）。 mIF 结果证实了 Cd28 KO 肿瘤中 CD4+ 和 CD8+T 细胞富集（图3H）。 CyTOF 分析显示，在 Cd28 KO 肿瘤中， DCs、CD8+T 细胞和 CD4+T 细胞富集，同时几个免疫抑制细胞群减少，这可能导致 Cd28 KO 肿瘤中抗肿瘤免疫力增强。单细胞结果也确认了 Cd28 KO 肿瘤中 cDC1 和 CD8+T 细胞的增加，并进一步鉴定了特定的细胞亚群（图3I-O）。这些结果表明 在乳腺癌中破坏细胞内 CD28 介导的免疫逃逸可能诱导出强效的抗肿瘤免疫应答。

图3

细胞内敲低 Cd28 可抑制肿瘤生长并克服抗 PD-1 耐药性

为探究是否可以通过抑制 Cd28 来启动抗肿瘤免疫反应以抑制肿瘤生长，研究使用 DOX 来敲低 4T1 细胞中的 CD28 （图4A，B）。结果表明，在体内诱导 Cd28 敲低的乳腺癌细胞能够抑制已建立肿瘤的生长，并且能够克服抗 PD-1 治疗的耐药性（图4C-E，M）。同时， Cd28 iKD （+ DOX ）联合抗 PD-1 治疗还能延长荷瘤小鼠生存期（图4F）。在 Cd28 敲低肿瘤中观察到 CD8+T 细胞、 IFNγ+CD8+T 细胞和 cDC1 的浸润增加（图4G-I，L）。虽然 CD4+T 细胞数量有所减少，但 IFNg+CD4+T 细胞比例增加（图4J，K）。总之，这些结果表明 在乳腺癌细胞中药物靶向 Cd28 可以激活抗肿瘤 CD8+T 细胞，抑制已建立的肿瘤生长并克服抗 PD-1 耐药性。

图4

Cd28 的缺失会减弱癌细胞中的 PD-L1 表达

为了探究癌细胞中 CD28 缺失克服免疫治疗耐药性的机制，研究对体外的 WT 和 Cd28 KO 4T1 细胞进行转录组分析。结果显示， Cd28 KO 4T1 细胞中有19个基因上调和115个基因下调，且下调基因富集于先天免疫相关通路。相比 WT 细胞， Cd28 KO 细胞中 PD-L1 mRNA 和蛋白的表达水平显著降低，而 CD28 能以剂量依赖方式促进 PD-L1 表达（图5A-G）。在人乳腺癌细胞中， CD28 沉默也会损害膜上 PD-L1 的表达（图5H）。此外， Cd28 敲低的人类乳腺癌细胞对 CD3/CD28 刺激的 CD8+T 细胞杀伤更敏感，而 PD-L1 抗体阻断无法强化该效用（图 5I，J）。这些结果表明 细胞内 CD28 促进了 PD-L1 的表达，从而介导肿瘤的免疫逃逸，影响抗肿瘤 CD8+T 细胞的反应。

图5

细胞内 CD28 与 Cd274mRNA 结合并募集 SNRPB2 来稳定癌细胞中的 Cd274mRNA

研究使用质谱分析和 RNA 结合蛋白（RBPs）技术来探究 CD28 如何调节癌细胞中 PD-L1 表达。结果显示 CD28 与 RNA 加工和代谢相关 RBP 相互作用最丰富（图6A，B）。鉴于 Cd28 敲除降低了 Cd274 mRNA 水平，研究推测 CD28 通过调节 Cd274 mRNA 来调节 PD-L1 表达，并通过实验证实 CD28 能直接与 Cd274 mRNA 结合（图6C-H）。此外， CD28 能通过推定的 RNA 结合基序直接与 Cd274 mRNA 相互作用（图6I）。在探索与 CD28 协同维持 Cd274 mRNA 稳定性的蛋白时，研究发现 CD28 和 SNRPB2 共定位，并在 IFNγ 刺激后增强，同时 CD28 与 Cd274 mRNA 的结合也增加，而在 CD28 缺失时这种结合减少（图6G，H，J-L)。这些结果表明 CD28 直接与 Cd274 mRNA 结合并募集 SNRPB2 来稳定 Cd274 mRNA 。

图6

CD28 高表达与 PD-L1 表达增加、 CD8+T 细胞浸润减少以及患者预后较差相关

为了确定上述发现的临床意义，研究分析了411例不同亚型乳腺癌患者样本中 CD28 表达与免疫细胞浸润的关联（图7A）。结果显示，在 TNBC 中， CD28 的表达更频繁，且随临床分期的增加而增加（图7B）。进一步分析发现，在 TNBC 肿瘤细胞周围聚集了更多的 CD8+T 细胞和 GZMB+CD8+T 细胞，其中 GZMB+CD8+T 细胞在10mm范围内更靠近 CK+CD28- 肿瘤细胞，表明其可能负责杀死 CD28- 肿瘤细胞（图7C-E）。此外， CD28 与 PD-L1 表达正相关，并且 CD28 高表达的患者预后较差（图7F-H）。同样地，癌细胞中 SNRPB2 表达与 PD-L1 的表达呈正相关，而与 CD8+T 细胞浸润负相关（图7I，J）。这些结果共同表明， CD28 促进 PD-L1 表达并抑制 CD8+T 细胞浸润，从而在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。

图7