原名： Polysaccharide Extracted fr om Sarcandra glabra Residue Attenuate Cognitive Impairment by Regulating Gut Microbiota in Diabetic Mice

译名： 草珊瑚残余物多糖通过调节肠道菌群减轻糖尿病小鼠认知功能障碍

期刊： International Journal of Biological Macromolecules

IF： .7

发表时间： 2024.05

通讯作者： 虞菊萍,刘玮,高向东

通讯作者单位： 中国药科大学

为了探索SERP对DE的潜在处理作用，我们对db/db小鼠给予400mg/kg/天的SERP 10周（图1A）。与模型组相比，SERP从第8周起显著阻止了体重增加（图1B）。SERP组的空腹血糖（FBG）和糖化血红蛋白（HbA1C）水平低于模型组，初步证实了SERP对2型糖尿病模型小鼠葡萄糖代谢的改善作用（图1C，D）。为了阐明SERP在胰岛素抵抗中的作用，我们进行了葡萄糖耐量试验（GTT），并测量了胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的产生。研究结果表明，SERP有效改善了糖尿病模型小鼠的胰岛素抵抗（图1E，F）。此外，连续给药10周后，SERP组显著调节糖尿病模型小鼠血清中高密度和低密度脂蛋白胆固醇（H/LDL-C）、总胆固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）和非酯化脂肪酸（NEFA）的水平，表明SERP具有调节脂质代谢的能力（图1G-K）。小鼠肝组织的H&E染色显示，如图1L所示，与模型对照组相比，SERP给药减轻了肝组织空化，表明SERP对糖尿病模型小鼠的组织保护作用。总之，SERP有效地调节糖尿病小鼠的葡萄糖和脂质代谢。

基于这些发现，我们通过Morris水迷宫探讨了SERP对db/db小鼠学习认知和空间定向能力的影响（图1M）。定位航行测试的结果（图1N和O）显示，所有组的总探索距离和平台潜伏期都随着训练过程而减少。与模型组相比，SERP处理组在训练的第三天表现出显著更低的总探索距离和平台潜伏期。这一趋势继续下去，到第四天，这两个参数都进一步降低。在图1P和Q所示的空间探索测试结果中，与模型组相比，SERP组在目标象限内的停留时间显著延长，并且在虚拟平台上的跨越次数显著增加。我们进一步研究了SERP对糖尿病小鼠脑组织的影响。如图1R所示，小鼠海马CA1和CA3区的H&E染色显示，模型组CA3区神经元明显稀疏无序，表明该组的神经损伤。然而，SERP组CA3区神经元肿胀的严重程度得到了有效缓解。此外，c-FOS基因是立即早期基因（IEG）中的代表性基因，其蛋白质产物与学习和记忆等中枢神经系统生理过程密切相关。因此，我们进一步对小鼠海马中的c-FOS蛋白表达水平进行了蛋白质印迹分析，结果显示，与对照组相比，db/db小鼠海马中c-FOS蛋白质水平显著增加（图1S）。SERP处理10周后，小鼠海马中的c-FOS蛋白水平显著下调。

图1 SERP调节db/db小鼠的糖脂代谢、认知功能和空间导航能力。 （A）SERP处理示意图。（B）体重。（C）空腹血糖水平。（D）HbA1C浓度。（E）葡萄糖耐量测试和曲线下面积（AUC）。（F）血清活性GLP-1浓度。（G-K）血清总HDL-C、LDL-C、T-CHO、NEFA、TG浓度。（L）肝切片的代表性H&E染色。比例尺，50μm，每组n=3。（M）训练中具有代表性的游泳路径。（N）小鼠移动的总距离。（O）小鼠到达逃生平台所需的总时间。（P）在空间探索测试中，在目标象限花费的时间和（Q）平台位置周围的跨越次数。（R）海马CA1和CA3区域的代表性H&E染色。比例尺，50μm，每组n=3。（S）海马组织中c-Fos的产生。与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和***p<0.0001，每组n=7。

SERP对糖脂代谢和认知功能障碍的调节作用取决于肠道微生物群多糖不能被宿主消化酶水解，而是被各种肠道微生物代谢。短链脂肪酸是这一过程中产生的主要代谢产物之一，在维持肠道稳态和调节宿主免疫方面发挥着关键作用。因此，我们假设SERP和肠道微生物群之间存在相互作用，可能有助于其功能。为了确定肠道微生物群是否参与SERP对糖脂代谢和认知改善的调节，我们用抗生素混合物处理小鼠，以减少很大一部分肠道微生物（图2A）。正如预期的那样，SERP对糖脂代谢的影响（图2B-L）和空间定向能力（图2P，Q）在抗生素干预后不再被观察到。而出乎意料的是，在同时使用SERP和抗生素处理的组中，HDL-C水平显著降低，显著低于抗生素组。先前的研究表明，肠道微生物群在脂质代谢中起着至关重要的作用，包括调节HDL-C水平。鉴于这些发现，我们合理地假设SERP单独施用具有提高HDL-C水平的潜力。然而，在抗生素的影响下，这种作用可能会减弱或模糊。在定位航行测试的结果中（图2M-O），尽管SERP联合抗生素处理组的总探索距离和平台潜伏期在第4天低于抗生素处理组，但仍高于SERP组。此外，在改善海马中央神经元排列和海马区c-FOS蛋白表达方面，抗生素处理组和SERP联合抗生素处理组之间没有观察到显著差异（图2S）。这些结果支持肠道菌群参与介导SERP对糖脂代谢和认知增强的影响。因此，我们合理地推测，肠道微生物群通过代谢SERP发挥其作用。通过微生物发酵产生的多种代谢产物可以作为肠道微生物群群落的中介，更有效地实现其健康促进功能。

在上述结果的基础上，我们假设SERP由肠道微生物介导，首先在肠道内发挥作用，然后通过“肠脑”轴调节行为能力。因此，我们检测了小鼠肠道屏障和肠道神经回路的致密结构。在正常的生理条件下，肠黏膜上皮细胞及其之间的紧密连接形成了致密的结构，确保了稳定的生理功能所必需的强大的肠道微环境。图3A显示了不同组小鼠的空肠、回肠和结肠的组织学切片。SERP给药后，糖尿病小鼠的炎症浸润减轻，绒毛病变出现改善迹象。相反，与SERP组相比，抗生素对照组和抗生素处理组的处理效果不那么明显。机械屏障是由肠上皮细胞及其紧密连接蛋白组成的单层结构，是哺乳动物肠黏膜屏障的最重要部分。因此，我们进一步评估了肠道机械屏障相关跨膜蛋白Occludin和Claudin的表达水平。如图3B所示，SERP显著上调db/db小鼠肠道中Occludin-1和Claudin-1的表达水平。然而，这种作用在抗生素干预后消失了，这表明SERP需要肠道菌群的帮助才能完成黏膜修复。

肠道和大脑之间的信息交换方式包括各种途径，神经回路促进器官间的直接交流。研究表明，存在一个由分布在哺乳动物肠道中的电兴奋细胞组成的复杂神经网络。该网络接收来自食物或信号分子发出的各种外部或内部信号的刺激，将这些信息作为电信号传输到中枢神经系统。这些信号协调身体运动、内分泌功能、食物摄入、情绪反应和行为能力。Diego V.Bohorquez´等人将这种位于肠道中的网络称为“肠道连接体”。因此，我们评估了肠道外周神经系统的功能。首先，我们采用蛋白质印迹分析来评估小鼠回肠组织中外周神经细胞标记蛋白“外周蛋白”的表达水平。外周蛋白通常用作外周神经元的标志物，用于中枢神经系统疾病（如帕金森病、自闭症）的临床研究。如图3C所示，与对照组相比，模型组小鼠回肠组织中外周蛋白的表达水平显著较低，这表明糖尿病小鼠的外周神经受损。SERP给药10周后，我们在小鼠的回肠组织中观察到外周蛋白水平的显著增加，而当给药抗生素时，这种上调受到阻碍，这表明SERP需要肠道微生物的帮助来修复受损的外周神经元。迷走神经通路作为“肠”轴内最快的信息交换通路，将哺乳动物的中枢神经系统与“第二大脑”——肠道外周神经系统连接起来。研究表明，肠神经细胞周围存在突触结构，在肠神经细胞内形成“神经上皮回路”，与中枢系统的神经回路互连，促进信息交换。因此，我们进一步采用免疫荧光染色来评估肠神经细胞中蛋白质基因产物（Pgp9.5）和突触肽（Syn）的表达水平。如图3D-H所示，SERP给药10周后，小鼠回肠组织中Pgp9.5和Syn蛋白表达显著增加，而当抗生素与SERP同时给药时，这种作用受到抑制。这进一步证实了由肠道微生物群介导的SERP可以有效地恢复受损的肠道神经上皮回路。总之，这些结果表明，SERP在肠道微生物的促进下，对肠道屏障、肠道神经元和受损的肠道神经突触发挥修复作用。

图3 SERP通过肠道微生物群恢复肠道屏障和神经回路功能。 （A）空肠、回肠和结肠切片的代表性H&E染色。比例尺，50μm，n=3。（B）回肠组织中的occludin-1/Claudin-1产生，n=4–5。（C）回肠组织中外周蛋白的产生，n=4。（D）Pgp9.5/回肠组织中突触肽（Syn）的产生。比例尺：20μm。（E-H）Pgp 9.5/Syn的相对面积和阳性细胞计数，n=5–7。与模型组相比，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和***p<0.0001。

在证实肠道菌群在SERP活性中的关键作用后，我们利用16S rRNA测序来表征SERP对肠道微生物组成的影响。如图4A所示，每个样本的稀释曲线表明了本研究中可接受的测序数据质量，突出了SERP组和模型组之间的显著差异。随后，我们使用Chao、Shannon和Simpson指数评估了每个样本的α-多样性，揭示了由于SERP处理，肠道微生物的丰富度和α-多样度发生了显著变化（图4B-D）。为了探讨SERP对β-多样性的影响，我们在操作分类单元（OUT）水平上对小鼠肠道菌群进行了主成分分析（PCA）。结果表明SERP组和模型组之间存在一定的分离（图4E-G）。在门水平上进行分析，如图4H-L所示，SERP处理降低了厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）的比例。此外，我们观察到，与SERP抑制的对照组相比，模型组中Tenericutes的丰度显著增加。研究表明，Tenericutes门与大脑相关疾病之间存在密切联系，这些细菌在患有大脑疾病的人肠道中显著增加，表明它们有可能成为肠道生物标志物。一个显著的观察结果是拟杆菌目_S24-7丰度的变化，在科水平上，db/db小鼠的SERP显著增加（图4M）。此外，拟杆菌目_S24-7的丰度与SERP介导的糖尿病小鼠脂质代谢和认知障碍的改善之间的相关性分析表明，随着拟杆菌目_S24-7的富集，SERP对糖尿病诱导的认知能力下降和脂质代谢紊乱的潜在处理作用增强（图4N）。这些发现共同表明，SERP显著改变了糖尿病小鼠的肠道微生物组成，显著富集了拟杆菌目_S24-7。拟杆菌目_S24-7可能是SERP在处理DE中发挥疗效的关键菌株。

图4 SERP改变肠道微生物群组成，特别是富集拟杆菌目_S24-7菌。 （A）观察到的OTU。（B–D）基于Chao指数、Shannon指数和Simpson指数的α多样性分析。（E-G）主成分分析。（H-L）门水平的细菌分类特征。（M）LEfSe在两组之间确定的鉴别分类群。（N）糖尿病小鼠中拟杆菌目_S24-7（%）的丰度与SERP介导的脂质代谢和认知障碍改善的相关性。与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，每组n=7。

拟杆菌目_S24-7是小鼠中主要的拟杆菌门成员，在碳水化合物利用方面表现出强大的能力，拟杆菌目_S24-7表现出显著的丁酸产量。因此，我们进一步测定了各组小鼠粪便中短链脂肪酸（SCFAs）的浓度变化。如图5所示，在SERP处理10周后，我们观察到糖尿病小鼠肠道中SCFAs的组成发生了显著变化。与模型组相比，SERP处理后粪便中丁酸的浓度显著增加（图5A）。这与所报道的拟杆菌目_S24-7_spp强大的产丁酸能力一致。结合之前的微生物组研究结果，这表明SERP通过调节肠道菌群组成，特别是拟杆菌目_S24-7的富集，进一步改变SCFAs，特别是促进丁酸的产生，对糖尿病相关的大脑疾病具有治疗作用。

图5 SERP对糖尿病小鼠粪便中SCFAs浓度的影响。 （A）丁酸、（B）正戊酸、（C）乙酸、（D）丙酸、（E）异戊酸。与对照组相比，#p<0.05，##p<0.01，####p<0.001。与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.0001，每组n=7。

SERP处理后的小鼠脂质图谱显示，肠道和血清中C18:0（硬脂酸）/C16:0（棕榈酸）比率显著降低，但大脑中没有显著变化（图6A-C）。据报道，膳食饱和脂肪酸，特别是C18:0/C16:0的比例，会影响代谢，可能导致小鼠严重的代谢紊乱和炎症。这可能归因于C18:0较低的氧化和三酰甘油的掺入，导致中间脂质代谢产物的积累。结合之前的研究结果，这表明SERP可能通过改变肠道中SCFA的浓度来调节脂质代谢。因此，为了进一步探索这一点，我们选择了棕榈酸（PA），一种饱和长链脂肪酸，作用于小鼠肠道内分泌细胞STC-1。本研究旨在模拟体内脂质沉积现象，并在肠道内分泌细胞内建立高脂模型，以检验SERP的特征代谢产物对肠道的干预作用。我们使用MTT法将STC-1细胞与不同浓度的PA孵育24小时后，图S1A中的结果表明，当PA浓度超过250μM时，细胞活力显著降低，显示出浓度依赖性。因此，我们选择与空白组有显著差异的最低浓度（250μM）进行后续建模。当与250μM PA孵育以损伤STC-1细胞时，我们使用MTT测定法给予不同浓度的SERP、乙酸（AA）、丙酸（PrA）、丁酸（BA）和戊酸（VA）24小时。图6D和图S1B-E中所示的结果表明，SERP、AA、PrA和VA不能有效改善STC-1细胞中的细胞损伤。然而，低浓度的BA显著提高了STC-1细胞的活力，并抑制了PA对细胞的破坏作用。此外，我们检测了BA对STC-1细胞中脂质积累水平的影响。我们通过油红O染色观察细胞内脂滴含量，揭示了丁酸减轻STC-1细胞中的脂质沉积（图6E-G）。此外，我们通过测量细胞裂解物中的甘油三酯（TG）含量，并从细胞代谢的角度评估丁酸对脂质代谢的影响，图S1F、G中的结果显示，在100μM PA诱导下，与空白组相比，蛋白质含量没有显著差异。然而，两组之间TG含量存在显著差异。因此，我们选择该浓度（100μM）作为建模浓度。用100μM棕榈酸诱导高脂细胞模型，随后给予不同浓度的丁酸24小时，测量细胞裂解物中的TG含量，如图6H所示。在500μM丁酸干预下，高脂细胞模型中TG含量显著降低，表明丁酸对肠道内分泌细胞脂质代谢的有效调节。

图6 丁酸对PA诱导的STC-1细胞的作用。 （A-C）肠、脑和血清中的C18:0/C16:0比例。（D）丁酸对PA诱导毒性的保护作用。（E-G）通过油红O染色，用PA培养的丁酸诱导的STC-1细胞的脂质积累。（H）用不同浓度的丁酸干预PA诱导的细胞中甘油三酯含量。与对照组比较，###p<0.01，###p<0.001。与模型组相比，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001，每组n=6。

总之，本研究的发现表明，SERP可以通过改变肠道微生物群的结构，特别是通过富集拟杆菌目_S24-7和增加丁酸浓度，有效调节肠道内分泌细胞的脂质代谢，修复受损的肠道屏障和上皮神经回路。这种调节有助于增强肠道神经系统及其与中枢神经系统的联系，从而对DE发挥治疗作用。这些发现为SERP在处理DE中的应用提供了实验证据。然而，我们必须承认本研究中的某些局限性。进一步阐明SERP神经保护作用的分子机制是必要的，并需要在未来的研究中进行更深入的探索，以充分揭示SERP作为一种潜在DE-处理剂的机制和潜在应用。