科研 | 浙大：米糠膳食纤维在体外发酵过程中对肠道微生物群组成和代谢的综合评估（国人佳作）

原名： Comprehensive assessment of rice bran dietary fiber on gut microbiota composition and metabolism during in vitro fermentation

译名： 米糠膳食纤维在体外发酵过程中对肠道微生物群组成和代谢的综合评估

期刊： Food Research International

IF： 7.0

发表时间： 2024.10

通讯作者： 肖航

通讯作者单位： 浙江大学，美国麻省大学

RB-SDF（可溶性米糠膳食纤维）的总碳水化合物、蛋白质和尿酸含量分别为61.37 ± 2.55%、2.05 ± 0.40%和6.85 ± 0.36%。在260-280 nm波长下，OD值（光密度）的增加表明样品中含有少量核酸和蛋白质（图1A）。RB-SDF的分子量为3.138 × 10 ³ （± 0.499%）kDa。在傅立叶变换红外光谱中（图1B），3400 cm ^-1 附近的宽吸收峰可能是羟基（O-H）伸缩振动所致。2926 cm ^-1 和2854 cm ^-1 处的微弱吸收峰是碳水化合物亚甲基上的C-H伸缩振动所致。1400-1200 cm ^-1 处的宽吸收峰是由C-H的变角振动引起的，这是糖类的特征。1200-800 cm ^-1 区域是多糖的指纹区。1083 cm ^-1 的特征吸收峰是β-半乳聚糖，而1033 cm ^-1 的吸收峰通常被认为是阿拉伯聚糖。此外，850 cm ^-1 处的吸收峰表明RB-SDF中存在α构型的吡喃糖。有研究认为，α-D-吡喃葡萄糖是RB-SDF的主要成分。RB-IDF（不溶性米糠膳食纤维）中纤维素C-O-C和C-O-H的收缩振动导致吸收峰出现在1046 cm ^-1 附近。

图1 米糠膳食纤维的基本特性 。 A：RB-SDF的紫外可见光谱。B：RB-SDF和RB-IDF的傅立叶变换红外光谱。

pH值是肠道微生物群在碳水化合物发酵过程中产酸能力的重要指标。在本研究中，我们选择葡萄糖作为阴性对照。这是因为前人的研究结果表明，饮食中的单糖是导致肠道炎症的罪魁祸首之一，特别是葡萄糖。葡萄糖可通过改变肠道微生物群的组成诱发IBD（炎症性肠病）。图2A表明了肠道微生物群发酵米糠膳食纤维过程中pH值随时间的变化。最初，所有组的pH值相似。BLK组（空白对照）在整个发酵过程中保持稳定的pH值。RB-SDF组的pH值在0-6 h内明显下降，直至48 h保持稳定。RB-IDF组的pH值也是先下降后上升，这可能是由于碳源耗尽，肠道微生物群发酵蛋白质，产生碱性含氮物质，如氨（图S1C）。INL组（菊粉）和GLU组（葡萄糖）的pH值都在最初的12 h内迅速下降。在12 h处，GLU组的pH值约为4.91，随后pH值上升。在体外发酵过程中，所有添加碳水化合物组别的pH值都在下降，这表明发酵过程非常活跃。与BLK组相比，RB-SDF和RB-IDF组的发酵反应更明显。菊粉和葡萄糖被肠道微生物群利用的速度比米糠膳食纤维快，这可能是由于米糠膳食纤维的纤维结构更复杂，导致微生物群落的利用率较低。结果表明，米糠膳食纤维可被肠道微生物群发酵，导致由酸引起的pH值降低，而不同类型膳食纤维的发酵和产酸速度各不相同。

在肠道发酵过程中，复杂多糖被肠道微生物群分解，我们利用碳水化合物活性酶（CAZymes）将这些物质转化为SCFAs和其他代谢产物，它们在滋养肠道黏膜和调节机体代谢方面发挥着关键作用。图2B显示，在米糠膳食纤维体外模拟肠道发酵过程中，总SCFAs以及乙酸（图2C）、丙酸（图2D）和丁酸（图2E）等单个种类的酸浓度都有所增加。RB-SDF组和RB-IDF组的总SCFA含量从0-48 h持续增加。在INL组中，总SCFAs的浓度在最初24 h内上升，随后趋于稳定。GLU组的SCFAs仅在发酵的前12 h内有所增加。即使是缺乏碳源的BLK组，由于肠道微生物群对蛋白质的降解，SCFAs也有所增加。在整个发酵过程中，与INL、GLU和BLK组相比，RB-SDF和RB-IDF组的SCFAs总浓度持续处于较高水平。这表明，肠道微生物群可以长期有效地利用菊粉和米糠膳食纤维来产生SCFAs，从而产生对肠道健康有益的影响。

图2 发酵过程中pH值和SCFAs的变化 。 A：pH值的变化。B-E：总SCFAs（B）、乙酸（C）、丙酸（D）和丁酸（E）的变化。

乙酸是发酵过程中产生的一种主要SCFA，在我们的研究中占SCFA总量的近50%，对SCFA的总体趋势有很大影响。它主要由乙酰-CoA生成，乙酰-CoA来自糖酵解，并可转化为丁酸。乙酸也是肠道厌氧菌的主要发酵产物，在肠道中占主导地位。丙酸的产生量低于乙酸，约占SCFAs总量的20%，其趋势与SCFAs总量相似。但与米糠膳食纤维组相比，INL组产生的丙酸明显较少。丙酸的形成来源于丙烯酸、丙二醇和琥珀酸，而琥珀酸为主要途径。丙二醇途径广泛存在于多种细菌群中。丁酸是肠道微生物群和肠上皮细胞之间的重要纽带，在平衡和调节炎症中发挥着重要作用。与乙酸和丙酸的产生趋势不同，肠道微生物群利用RB-SDF和RB-IDF产生的丁酸更多，而GLU组和INL组的丁酸产量明显少于BLK组。丁酸的产生主要在肠道细菌通过丙酮酸和乙酰-CoA代谢复杂多糖的过程中，其他途径来源于氨基酸。葡萄糖是一种简单的单糖，肠道微生物群很难利用它来产生SCFAs。然而，葡萄糖干预可能会导致肠道微生物群的组成发生变化，并产生其他有机酸，如丙酮酸、乳酸和琥珀酸，从而进一步导致pH值下降。菊粉作为一种公认的益生元，产生丁酸的能力与其分子量、来源和微生物群落有关。这些代谢过程对于维持肠道微生态系统的健康和宿主的整体健康至关重要，会影响代谢途径、免疫反应、炎症和激素分泌。因此，通过饮食和肠道微生物群相互作用了解SCFA产生，这对饮食干预促进健康至关重要。

高通量测序可用于分析肠道微生物群组成及其对不同饮食干预（如添加米糠膳食纤维）的变化。通过比较分析24 h发酵前后的RB-SDF、RB-IDF、BLK、INL和GLU组内的微生物群落，我们可以深入了解被其影响的物种。

一般来说，疾病风险与肠道微生物的多样性成反比。图3A-C显示了α多样性指数的结果，揭示了群落丰富度（Chao1）（图3A）和群落多样性（Shannon、Simpson）（图3B-C）。结果表明，五组之间的群落丰富度和多样性都存在差异。米糠膳食纤维组（RB-SDF和RB-IDF）的群落丰富度（Chao1指数）明显高于BLK组，统计学意义为p < 0.05。不同碳水化合物来源的干预导致微生物多样性的显著变化。

主坐标分析（PCoA）用于直观显示不同样品之间微生物组成的异同，有助于了解微生物群落的结构和功能。PCoA结果（图3D）显示，五组之间存在显著的统计学差异，样本距离热图（图S2）进一步证实了这一点。这表明米糠膳食纤维干预显著改变了肠道微生物群结构。

图3 各组细菌组成概况的分析 。 A-C：α多样性指数。Chao指数（A）、Simpson指数（B）和Shannon指数（C）。D：基于Bray-Curtis的PCoA。不同字母表示不同组间存在显著差异（p < 0.05）。

图4A-B展示了不同组的微生物在门和属水平的组成。在门水平，微生物组成以变形菌、梭杆菌、拟杆菌和厚壁菌为主。BLK组的梭杆菌较多。GLU组的变形菌含量明显较高，但不含梭杆菌。INL组含有拟杆菌、厚壁菌和放线菌，但不含梭杆菌。RB-SDF组含有大量的拟杆菌。常见的肠道有益微生物主要是厚壁菌、拟杆菌和放线菌，这表明RB-SDF和RB-IDF在促进有益微生物生长上的作用与菊粉类似。在属水平上，干预组主要由埃希氏-志贺氏菌、梭杆菌、拟杆菌和链球菌组成。与BLK组相比，补充米糠膳食纤维的组别中梭杆菌的含量较少。梭杆菌含量高可能与恶性大肠癌细胞的产生和转移有关。与INL组不同，米糠膳食纤维组的双歧杆菌含量较低。此外，RB-SDF组的拟杆菌含量增加。与GLU组相比，米糠膳食纤维组的埃希氏-志贺氏菌和链球菌含量较低，这表明米糠膳食纤维具有抑制致病菌的潜在能力。

为了在这五组中寻找重要的生物标志物，我们对操作分类单元（OTU）进行线性判别分析效应大小（LEfSe），以生成LDA得分分布直方图（图4C）和进化分支图（图4D）。直方图显示了在属水平上LDA得分大于2的物种，这表明这些生物标志物具有重要的统计学意义。就相对丰度而言，所有样本中排名前50位的物种被归类为厚壁菌、变形菌、拟杆菌、放线菌、梭菌和 Desulfurida 。在BLK、GLU、INL、RB-SDF和RB-IDF组中，分别有4、8、6、21和26个OTUs存在显著差异。与GLU组和BLK组相比，INL组、RB-SDF组和RB-IDF组都能显著降低有害细菌（如埃希氏-志贺氏菌和梭杆菌）的含量。埃希氏-志贺氏菌是一种潜在的致病菌，它在肠道微生物群中的比例升高与肥胖症和克罗恩病等代谢性疾病呈正相关性。每个组都促进了不同类型的有益微生物。在RB-SDF组中，考拉杆菌和副拟杆菌的丰度更高。考拉杆菌能产生SCFAs，包括乙酸和丙酸，而副拟杆菌主要产生乙酸和琥珀酸等糖酵解的终产物。此外，格氏副拟杆菌和狄氏副拟杆菌已被证明可调节由肥胖引起的肠道菌群失调。在RB-SDF组中，拟杆菌明显增多。拟杆菌在肠道中起着至关重要的作用，因为它们是将多糖分解成寡糖和单糖的关键，从而提供给其他微生物产生SCFAs。在RB-IDF组中，前三种优势物种是 Tyzzerella 、 Pseudoflavonifractor 和毛螺菌科_UCG_004。毛螺菌科属于厚壁菌门，是肠道微生物群的核心成分，从出生起就定植于肠道腔内。它们不仅善于利用食物中的多糖，而且是SCFAs的主要生产者之一。在INL组中，双歧杆菌是优势物种之一。菊粉作为一种公认的益生元，可被双歧杆菌和乳酸杆菌利用，生成乙酸和乳酸。与RB-SDF和RB-IDF相比，菊粉的结构更简单，可被肠道微生物群快速发酵，因此菊粉的发酵速度更快，导致发酵过程中pH值持续下降。测序结果表明，RB-SDF和INL都能促进有益菌的生长，而肠道微生物群的底物特异性导致了各种碳水化合物的不同益生机制。