背景介绍
RNA的表观转录组修饰广泛影响RNA的代谢与功能，与各类疾病的发生发展密切相关。目前已发现有一百多种修饰类型，其中N6甲基腺苷（m6A）分布最为广泛，对m6A RNA的深度分析将有助于推动其在精准诊断等领域的推广和应用。尤其在单细胞水平上的RNA甲基化分析对于深入了解分子机制，理解单细胞异质性至关重要。尽管m6A检测技术已经取得了长足发展，但仍缺乏针对特定m6A位点的多重分析技术。为了解决这一技术问题，实现单细胞m6A RNA的多路复用、空间分辨成像，
同济大学附属第十人民医院
朱小立教授、沈兵教授、李文星博士
团队联合
上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心
潘秋辉教授
团队
合作开发了一个基于邻位交换反应介导的多色编码技术（PREEM）。PREEM通过“AND”布尔逻辑识别，结合朱小立团队前期发展的“CAD-HCR”原位信号扩增技术（Sci Adv, 2022, 8, 2, abk0133）以及荧光编码技术（J Am Chem Soc, 2024, 146, 24, 16428-16439），实现了单细胞水平上多个m6A RNA的原位成像。这也是朱小立教授团队继实现单细胞空间蛋白组分析之后，在单细胞空间转录组研究领域的全新探索。
以“
Multichrome encoding-based multiplexed, spatially resolved imaging reveals single-cell RNA epigenetic modifications heterogeneity
”发表在
Nature Communications
上。
设计原理
PREEM的核心涉及发夹探针（PH1和PH2）和起始探针（PI）的邻位交换反应。PH1和PH2形成了一个“AND”布尔逻辑计算，可以双识别m6A修饰和靶RNA序列，进一步触发基于原位HCR的多色编码（
图1
）。
图1. PREEM系统的构建。
结果介绍
首先，PREEM系统的性能在磁珠体系上得以验证。通过设定不同逻辑门组别证明了该系统的可行性分析及各元件必要性（
图2a-e
）。并通过形态表征以及荧光成像证明了PREEM系统具有信号放大和编码性能（
图2f-i
）。
图2. PREEM可行性表征。
随后，PREEM系统在细胞的性能得以进一步验证。相比于传统免疫荧光、FISH技术，PREEM可以实现单分子水平的m6A RNA特异性表征（
图3a-f
）。且结果与实验室金标准MeRIP-qPCR基本一致（
图3g-h
）。与FISH的共定位分析进一步证实了PREEM技术的准确性（
图3i-k
）。
图3. PREEM系统在HeLa细胞中的m6A成像。
作者进一步构建了三种甲基化模型证实了PREEM系统的响应性：1）热应激条件下m6A水平升高（
图4a-f
）；2）METTL3敲低条件下m6A水平下调（
图4g-l
）；3）ACTB敲低条件下，总m6A水平基本不变但ACTB水平降低（
图4m-r
）。
图4. PREEM可以准确响应细胞内m6A动态变化。
随后，作者证实了PREEM系统在细胞和RNA类型具有普适性（
图5a-b
），并以多色编码实现了细胞内6种m6A RNA的同时成像分析与单细胞表达、定位异质性分析（
图5c-f
）。基于这一成果，作者还揭示了药物作用下的特定m6A RNA景观变化（
图6
）。
图5. 基于PREEM的m6A RNA多重成像分析。
图6. 基于PREEM的药物处理下m6A RNA多重成像分析。
最后，通过结合可逆组装，该体系还具备进一步拓展通量的价值，可满足不同生物医学场景需求（
图7
）。
图7. 基于可逆PREEM的m6A RNA多重成像分析。
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总结展望
】
