场发射扫描电镜在生物医学中的多维度应用

扫描电镜自问世以来，已成为生物医学研究中不可或缺的工具。

脊椎动物细胞和组织具有复杂的结构组织，从分子水平到器官系统层面呈现出高度有序性。这种结构上的精密组织直接决定了其功能的实现途径。当这种结构受到破坏时，相应的生理功能也随之发生障碍，从而导致各种疾病的产生。因此，深入理解细胞和组织的微观结构对于阐明其 生理功能和病理变化机制 具有重要意义。

本文将系统阐述 FESEM 在哺乳动物细胞和组织研究中的应用价值、技术优势、样品制备方法以及实际研究案例。

FESEM 的 优势

与传统热电子发射源相比，场发射源产生的电子束具有更高的亮度、更低的能量分散和更小的 束 斑尺寸，这些特性使 FESEM 能够在低加速电压下实现纳米级的分辨率，大大提高了生物样品成像的质量和信息量。

备注：低电子束能量条件下进行样品成像，这大大减少了电子束对样品造成的辐射损伤，从而更好地保存样品的原始精细结构。

FESEM 可以检测 大范围的细胞和大型样本，并提供 感兴趣 特征与其他细胞、组织、器官之间关系的背景信息。 因此 ，研究者能够识别组织内细胞组织的细节及其在发育过程或病理状态下可能发生的变化。

样品制备方法

样品制备是关键环节。水分含量高的生物样品必须经过适当处理。传统的样品制备流程通常包括 固定、脱水和干燥 三个主要步骤。

最常用的固定剂是戊二醛，它能够与蛋白质分子交联，形成稳定的网络结构。对于更好的膜结构保存，通常会结合使用四氧化锇进行后固定。固定后，样品需要通过系列浓度梯度的乙醇或丙酮溶液进行脱水，最终达到完全脱水状态。然而，这些传统技术可能导致样品收缩和结构扭曲，尤其是在干燥过程中。

为了克服 这种 局限性，研究者开发了多种先进的样品制备技术 ， 其中最为突出的是快速冷冻技术，如 高压冷冻和喷射冷冻 等，这些技术可以在毫秒级时间内将样品冷冻至超低温，从而最大限度地保存细胞的 " 生命状态 " 结构。

快速冷冻后的样品可以通过冷冻干燥或冷冻代替技术处理，以去除水分而不引起传统干燥方法产生的结构变形。这些技术虽然能够提供卓越的结构保存，但需要专业设备和特殊技术， 对大多数脊椎动物组织的应用仍面临挑战 。

OTOTO 技术及其优势

在不能使用冷冻技术的情况下，锇 - 硫代碳氢嗪 - 锇（ OTOTO ）协议提供了一种有效的替代方案。该协议在初始使用四氧化锇固定后，依次将组织暴露于硫代碳氢嗪（ TCH ）和四氧化锇，并重复这一过程（ Os-TCH-Os-TCH-Os ）。每个步骤之间需进行彻底冲洗，以去除未结合的化学物质。

此方法具有三个主要优势：首先，它增强了整个样品的导电性，而不仅仅是表面，使样品能够在无需喷金属涂层的情况下进行观察；其次，它避免了金属颗粒沉积在样品表面可能带来的 细节掩盖 问题；最后， OTOTO 处理能够赋予组织一定程度的刚性，减少干燥过程中的结构变形。

备注：与单独使用单宁酸的方法相比， TCH 处理减少了样品表面的沉积物，提供了更清晰的表面细节观察。

FESEM 在细胞表面结构研究中的应用

细胞表面微结构的识别与分析

不同类型的细胞常常具有独特的表面特征，例如上皮细胞可能具有丰富的微绒毛，巨噬细胞表面可能布满内吞小泡，神经元可能展示特有的树突和轴突结构。这些表面特征不仅是细胞身份的标识，也反映了细胞的功能状态。

通过 FESEM ，研究者能够以高分辨率捕捉这些微观结构，并对其形态、分布和动态变化进行定量分析。例如，在 肠上皮细胞 研究中， FESEM 可以清晰展示微绒毛的排列模式和密度，这对于理解营养物质的吸收过程至关重要。

细胞极性与表面特化结构

在上皮组织中，细胞表面根据其位置和功能表现出显著的特化。通过 FESEM 观察，研究者可以区分同一细胞的不同表面：腔内（顶端）表面可能涉及分泌、吸收或环境相互作用；侧面表面可能与组织中相邻细胞有相互作用；基底表面可能与细胞外基质或其他细胞类型如神经元相互作用。这种表面特化是细胞极性的直接体现，对于维持组织完整性和功能至关重要。

FESEM 能够提供这些特化结构的高分辨率 立体 图像，帮助研究者理解细胞极性如何支持其生理功能。

膜蛋白分布与微区域组织

细胞表面被复杂的大分子复合物覆盖，包括各种膜蛋白、糖蛋白和脂类。这些分子可能均匀分布或聚集在特定区域，形成功能性微区域。通过结合免疫金标记技术， FESEM 可以实现 特定膜蛋白的定位研究 。在这种方法中，抗体连接的金颗粒可以通过背散射电子 （ BSE ） 检测清晰识别，从而揭示目标蛋白的分布模式。这种方法特别适用于研究膜蛋白的聚集行为及其与细胞功能的关系，如信号转导、物质转运和细胞黏附等过程。

FESEM 在组织结构研究中的应用

组织内细胞组织与空间排布

组织是由多种细胞类型按特定方式排列组成的功能单位。 FESEM 能够在大视野下观察组织内细胞的空间排布和相互关系，这对于理解组织功能至关重要。例如，在肾小体研究中， FESEM 可以清晰展示 足细胞与内皮细胞之间复杂的滤过屏障结构 ；在血管系统研究中，可以观察内皮细胞的连续排列及其与平滑肌细胞的相互关系。通过分析这些空间结构，研究者能够建立组织形态与功能之间的联系，为理解生理和病理过程提供基础。

细胞 - 细胞连接与相互作用

细胞之间的连接是维持组织完整性和功能的关键结构。 FESEM 能够高分辨率地展示各种细胞连接装置，如紧密连接、黏附连接、间隙连接和桥粒等。这些连接不仅在物理上将细胞联系在一起，还介导细胞间的信号传递和物质交换。通过 FESEM 分析，研究者可以评估连接复合物的完整性、密度和分布特征，从而理解组织屏障功能和细胞通讯机制。特别是在上皮和内皮组织研究中，细胞连接的完整性对于理解组织渗透性和生理屏障功能具有重要意义。

细胞外基质的组织与功能

细胞外基质（ ECM ）是组织中细胞之外的非细胞成分，包括各种蛋白质、糖蛋白和多糖等。 FESEM 能够展示 ECM 的三维网络结构及其与细胞的相互关系。例如，在结缔组织中， FESEM 可以呈现胶原纤维的排列模式和弹性纤维的分布；在基底膜研究中，可以观察其网状结构及与上皮细胞的连接方式。这些观察对于理解 ECM 在维持组织结构、细胞迁移、组织修复和疾病进展中的作用具有重要价值。

FESEM 在病理样本研究中的应用

疾病状态下的细胞形态变化

在病理状态下，细胞常常表现出显著的形态变化，这些变化是疾病诊断的重要依据。 FESEM 能够捕捉这些形态学改变的细微细节，如肿瘤细胞表面微绒毛的异常增多、病毒感染细胞的表面结构变化、炎症反应中白细胞的形态特征等。这些观察不仅有助于疾病的诊断和分型，还能够提供疾病机制的线索。例如，在某些神经退行性疾病中， FESEM 可以观察到神经元树突棘的减少和形态异常 ，这可能与认知功能障碍直接相关。

组织病理学的三维理解

传统的组织病理学主要基于二维切片观察，而 FESEM 提供了三维视角，使研究者能够更全面地理解病理变化。例如，在肾小球疾病研究中， FESEM 可以展示足细胞足突融合的空间分布特征；在血管病变研究中，可以观察内皮损伤和血栓形成的三维结构。这种三维理解有助于揭示病理过程的空间进展模式和细胞间相互作用的改变，为疾病机制研究提供新的视角。

病原体 - 宿主相互作用的可视化

FESEM 在病原体 - 宿主相互作用研究中具有独特价值。它能够直观展示病原体如何附着、侵入宿主细胞的过程，以及宿主细胞的应答反应。例如，在细菌感染研究中， FESEM 可以观察 细菌菌毛与宿主细胞表面受体的相互作用 ；在病毒感染研究中，可以捕捉 病毒粒子附着和出芽的过程 。这些观察为理解感染机制和开发防治策略提供了重要信息。结合免疫标记技术， FESEM 还能够定位参与病原体 - 宿主相互作用的关键分子，进一步揭示感染过程的分子机制。

FESEM 与其他显微技术的结合应用

FESEM 与免疫标记技术的整合

免疫标记 FESEM 是将特异性分子识别与高分辨率形态学观察相结合的强大工具。通过使用连接金颗粒的特异性抗体，研究者可以在 FESEM 中定位特定蛋白质或抗原。金颗粒在 BSE 模式下表现为明亮的点，可以与常规二次电子图像叠加，从而实现结构和功能的关联观察。这种技术对于研究膜蛋白分布、细胞连接组分和信号分子的空间定位具有重要价值。然而，免疫标记与结构保存之间存在一定的技术平衡，研究者需要根据具体研究目的优化样品制备方案。

相关显微技术与多维数据整合

为了获得更全面的生物学信息， FESEM 常与其他显微技术结合使用，形成相关显微学方法。例如，同一样品可以先通过共聚焦显微镜进行活细胞或荧光标记观察，然后再进行 FESEM 成像，从而将动态过程与超微结构关联起来。此外， FESEM 还可以与透射电镜（ TEM ）、原子力显微镜（ AFM ）等技术结合，提供互补的结构信息。近年来，先进的计算方法使得不同模态显微镜数据的配准和融合成为可能，这为细胞和组织研究提供了前所未有的多维视角。

体 SEM 技术的发展与应用

体 SEM 技术是近年来发展起来的三维超微结构研究方法，如连续切片 SEM （ Serial Block-Face SEM ）和 FIB-SEM 。这些技术通过自动化的连续切片和成像，能够获取大体积样品的三维超微结构数据。在 FESEM 平台上实施这些技术，可以结合高分辨率和大视野的优势，为复杂生物结构的三维重建提供理想解决方案。例如，在神经科学研究中，体积 FESEM 技术可以重建神经元之间的突触连接网络；在细胞生物学研究中，可以分析细胞器的三维组织和相互关系。这些应用极大地扩展了 FESEM 在生物医学研究中的应用范围。

案例讨论 ： FESEM 在内耳研究中的应用

内耳感觉上皮的超微结构分析

内耳是听觉和平衡感知的关键器官，其中包含高度特化的感觉上皮。 FESEM 在内耳研究中发挥着重要作用，特别是在感觉 毛细胞形态学 研究方面。

通过 FESEM ，研究者能够清晰观察毛细胞顶端的纤毛束结构，包括不同高度的立体纤毛和单个运动纤毛的排列模式。这些纤毛束的完整性和排列规律性对于听觉和平衡功能至关重要。 FESEM 观察还揭示了支持细胞的表面特征及其与毛细胞的空间关系，这对于理解内耳感觉上皮的发育和功能具有重要意义。

内耳发育过程中的结构变化

内耳的发育是一个复杂的形态发生过程，涉及细胞增殖、迁移、分化和凋亡等多种细胞行为。 FESEM 能够在不同发育阶段捕捉内耳结构的变化，如耳蜗管的卷曲形成、半规管的发育以及感觉上皮的分化。这些观察帮助研究者理解内耳形态建立的时空调控机制。特别是在毛细胞发育研究中， FESEM 可以观察到纤毛束形成和成熟的过程，这对于理解听力发育和先天性听力障碍的机制具有重要意义。

图 1 内耳感觉上皮 细胞 在不同放大倍率下的结构细节

(A) 完整的小鼠科蒂氏器 ：图中展示了小鼠听觉感觉上皮 —— 科蒂氏器的完整螺旋结构，箭头标记了感觉上皮的薄条位置。立体图像细致呈现了科蒂氏器螺旋的三维形态，有助于理解其整体结构。

(B) 毛细胞的分布与结构（豚鼠） ：描绘了沿科蒂氏器螺旋排列的听觉毛细胞。这些细胞因其顶端表面具备规则排列的毛束而得名。毛细胞排列成一排内毛细胞（ IHC ）和三排外毛细胞（ OHC ），每个毛细胞彼此间由支持细胞隔开。

(C) 更高放大倍率下的小鼠科蒂氏器结构细节：用于展示毛细胞和支持细胞的表面特征。毛细胞上的毛束由按高度递增排列的 “ 立体纤毛 ” 组成，所有毛细胞的毛束极化方向均一致。相比之下，内毛细胞的立体纤毛明显宽于外毛细胞。支持细胞表面特征明显不同，体现其多样性。

(D) 不同细胞表面的特征（豚鼠科蒂氏器） ：部分细胞表面出现内吞囊泡的开口（箭头标示），另一些细胞则以长微绒毛为显著特征。该差異揭示了细胞在组织功能上的特化。

(E, F, G) 立体纤毛周围的细节：

- (E) 小鼠前庭感觉上皮中，立体纤毛间存在侧向连接（箭头标示），加强了毛束的稳定性。

(F) 蝾螈囊斑中，短立体纤毛顶端与后方较长立体纤毛通过尖端连接相连，连接方向与束极化方向一致（箭头标示）。

(G) 小鼠外毛细胞的尖端连接在高倍率下呈现，顶部可能分叉，揭示了其精细结构。

(H) 小鼠科蒂氏器中的细胞组织 ：感知上皮的核心组织结构包括支持细胞和外毛细胞。支持细胞的细胞体扩大，基部包裹着外毛细胞（箭头），并以一定角度延伸至上皮表面。外毛细胞的细胞体朝相反方向倾斜，与支持细胞形成特定空间关系。

(I) 毛细胞丧失后的上皮重组现象 ：毛细胞消失后，上皮重组，由支持细胞主导。此时，支持细胞变得膨大且呈直立状态，表面具有大量短微绒毛，侧膜特征性的短突起也更为明显。这些变化反映了组织应对损伤后的动态调整能力。

比例尺说明：- A ： 100 µm- B ： 5 µm- C ： 2.5 µm- D ： 1 µm- E ： 200 nm- F ： 100 nm- G & H ： 5 µm

内耳病理状态的 FESEM 观察

在内耳病理研究中， FESEM 提供了独特的观察视角。例如，在噪声损伤和耳毒性药物研究中， FESEM 可以检测毛细胞纤毛束的断裂、融合和消失等病理变化；在老年性听力损失研究中，可以观察到毛细胞和支持细胞的退行性变化。这些观察为理解内耳疾病的发病机制和评估治疗方法的效果提供了重要依据。结合免疫标记技术， FESEM 还能够定位参与内耳病理过程的关键分子，如细胞凋亡相关蛋白、离子通道和细胞连接蛋白等。

图 2 内耳病理细节和不同制备技术下的效果

(A) 外毛细胞毛束的形态异常：图示显示外毛细胞的毛束形状发生异常变化，部分立体纤毛从毛束中缺失（箭头指示）。毛细胞顶端的表面形态清晰，表面轮廓与毛束形状一致（巴德 - 比德尔综合征（ BBS ） -6 敲除小鼠）。

(B) 内毛细胞毛束的立体纤毛异常：单个毛束内的立体纤毛在长度和宽度上出现显著差异（ Plastin-1 敲除小鼠）。

(C) 常规制备样本的结构特点：在常规制备的样本中可以观察到细胞表面膜的皱褶，同时部分立体纤毛呈现一定程度的弯曲现象。

(D) OTOTO 程序制备样本的改良效果：通过使用 OTOTO 程序制备的样本，细胞表面膜表现出更加光滑的特征，同时立体纤毛保持了直立的形态，显示更理想的结构。

比例尺说明：- A