【GenePilot】脑脊液ctDNA检测在中枢神经系统领域的应用案例——脑转移瘤

往期回顾

肿瘤发生进展转移到中枢神经系统被确诊时已是晚期，预后不良。由于脑部手术风险较高、脑组织不易获取，因此肿瘤发生进展转移到CNS（中枢神经系统）的相关机制很难进行研究，针对脑转移肿瘤的精准诊疗也很难开展。

ctDNA 液态活检技术 （血液）基于其微创、精准等特点可打破这一困境；但对于脑转移肿瘤来说，因为血脑屏障的存在，脑肿瘤释放的DNA很难在血浆中被检测到，故而科研人员开始尝试利用脑脊液（Cerebrospinal Fluid，CSF）开辟脑转移瘤的新型“液态活检”技术的创新。

本期小编将与大家分享脑脊液ctDNA检测应用于脑转移瘤方向的经典探索研究进展。

脑脊液细胞学检查属于中枢神经系统疾病的临床常规检测技术。脑脊液ctDNA检测与传统细胞学检测相比，灵敏度如何？CSF ctDNA是否可以鉴定到与临床相关的基因突变？

本研究是 通过腰椎穿刺方式获取脑转移瘤的脑脊液样本，利用NGS平台检测肿瘤相关的基因组变异状态 ，从而挖掘临床相关分子生物标志物，为临床疗效评估、肿瘤复发动态监控等应用提供参考信息。

本次实验针对41例实体瘤患者，其中包括32例中枢神经系统（CNS）肿瘤转移患者（非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等脑转移或者脑膜转移）和9例未发现脑转移的患者，利用腰椎穿刺采集CSF标本，再通过NGS进行341个癌症相关基因的检测，分析CSF中游离肿瘤DNA（ctDNA）的变异情况。

1. CSF cfDNA与 Cell-Pellet DNA突变检测结果比较

将CSF进行离心，分离出CSF细胞沉淀（cell pellet）与上清液（supernatant），分别进行341个癌症相关基因变异状态的检测。针对4个病人（已知突变SNP位点：BRAF V600E、EGFR L858R和KRAS G12C）进行CSF细胞沉淀与上清液的突变位点检测。结果显示，上清液中CSF cfDNA检出了更高突变频率的变异位点；另外，针对 HER2 扩增的患者，CSF cfDNA检出更高拷贝数变异的 HER2 以及其他基因的扩增（ CDK12、CCND1、PIK3R2 ）。

总之，CSF cfDNA能够100%检测到已知的分子突变状态，而Cell-Pellet DNA中只有63%的患者能够检测到已知突变。实验结果表明， 与Cell-Pellet DNA相比，脱落肿瘤来源的DNA进入CSF cfDNA中最有可能被检测到 。

图1. CSF细胞沉淀与上清液突变检测结果的比较

A：CSF细胞沉淀（cell pellet）与上清液（supernatant）分离操作示意图；

B：CSF cfDNA和pellet DNA已知基因突变频率结果的比较；

C：患者CSF cfDNA和pellet DNA靶向区域的测序覆盖度情况

2.  CSF ctDNA在CNS不同癌种的检测情况

对41位患者进行脑核磁及CSF细胞学检查，32例被确诊或怀疑为中枢神经系统（CNS）肿瘤患者（非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等发生脑转移或者脑膜转移的患者）和9例未发生转移的患者；采集41位患者 CSF样本，进行341个癌症相关基因检测并分析CSF ctDNA相关基因的突变情况。结果显示，脑转移患者中细胞学阳性率为50%（16/32），基因突变检出率为63%（20/32），细胞学阳性患者基因突变检出率为100%。

图2. 41个可能发生CNS转移的患者样本信息以及CSF检测结果

3． CSF ctDNA中具有临床意义的基因突变

为了验证CSF ctDNA基因突变的临床意义，将检测结果与原发检测的分子突变情况进行比较。结果表明，在所有可检测的患者中，CSF ctDNA检测到的突变情况与前期确定的分子突变结果一致（图2）。

对于CSF ctDNA基因组分析来说，一个重要的潜在应用是鉴定原发灶中肿瘤分子靶向治疗后的耐药机制。 利用341个基因（最大广度、最大深度的包含CSF ctDNA相关的耐药位点）进行检测，对12例经 EGFR、ALK、HER2 或 BRAF 抑制剂治疗后CNS病灶发生进展的肿瘤患者样本进行测序分析（图3），并结合影像学检测，结果显示：

图3. 12例肿瘤患者经靶向治疗后CSF ctDNA基因组分析确定耐药产生的结果 （向右滑动可看）

图4. CSF ctDNA基因组分析和MRI相结合确定经过EGFR TKIs治疗产生耐药的分子机制 （向右滑动可看）

2例经EGFR-TKI治疗后出现EGFR T790M突变（图4），1例经厄洛替尼治疗后出现KRAS G12A突变，1例BRAF V600E突变黑色素瘤发现NRAS G12R突变，这4例（三分之一）患者确认了耐药突变；1例（patient 8） HER2 扩增乳腺癌病患，经过HER2靶向治疗后在CSF ctDNA中检测到PIK3CA H1047R突变，这一突变属于乳腺癌中潜在的曲妥珠单抗耐药性突变，1例（patient 15）BRAF V600E突变黑色素瘤，脑脊液ctDNA检测到 PTEN 缺失，以上2例病患没有肿瘤组织对照检测结果，怀疑其产生了耐药。

本研究为脑转移瘤中脑脊液ctDNA检测的临床应用提供了良好的案例支持：在不同类型的脑转移瘤病例中，CSF ctDNA（检出率63%）比传统CSF细胞学检查（检出率50%）更灵敏；在脑转移瘤患者CSF中可检测到与临床相关的基因变异。