高效RNA环化技术，提升滚环翻译效率超千倍

细胞与基因治疗领域 · 公众号 · · 2024-12-17 10:44

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当外源mRNA被引入细胞后，其携带的目标基因可以在细胞中表达，这构成了mRNA疗法的基础。尽管在1990年代取得了一些积极的成果，mRNA疗法的开发因mRNA的不稳定性、高免疫原性以及递送效率低等挑战而进展缓慢 【1】 。近年来，核苷酸修饰和RNA递送技术的进展推动了mRNA疫苗的成功。然而，在蛋白质替代疗法等其他应用中，mRNA的不稳定性依然是一个挑战 【2】 。

环状RNA是一种具有共价闭环结构的单链RNA分子，由于其对外切酶的耐受性，比线性mRNA更加稳定，因此被认为是mRNA疗法的一种潜在替代方案。天然的环状RNA既可以作为microRNA和蛋白质的 “海绵” ，也可以作为翻译的模板 【3, 4】 。翻译起始是蛋白质合成的限速步骤，经典的翻译起始依赖于线性mRNA 5′端的帽子结构，而环状RNA可借助内部核糖体进入位点（IRES）实现高效翻译起始 【5】 。如果环状RNA缺少阅读框内的终止密码子，核糖体能够围绕环状RNA多次完全翻译，生成多聚蛋白，这一过程被称为滚环翻译（RCT）。多聚蛋白可通过蛋白酶或自切割序列分解为单体蛋白。理论上，RCT的效率可达单次翻译的100倍 【6, 7】 。然而，RCT仍面临两大主要挑战：低翻译起始效率以及当前RNA环化方法中可能引入的多余序列 【8】 。

近日，英国剑桥MRC分子生物学实验室（MRC-LMB）的Venki Ramakrishnan （2009年诺贝尔化学奖得主）团队在 Nature Biomedical Engineering 发表了一篇题为 Efficient circular RNA synthesis for potent rolling circle translation 的文章（杜易飞博士为第一作者兼共同通讯作者）， 介绍了一种高效且精准的环状RNA合成技术，并将高效的病毒IRES应用于RCT，大幅提高了RCT效率。

环状RNA可以通过化学或酶促连接法以及基于Group I内含子的（PIE）方法在体外合成 【9】 。其中，PIE能够有效生成约5,000 nt的环状RNA。然而，PIE在生产长环状RNA时产率较低，同时引入的细菌序列可能引发免疫反应，并且无法合成完全修饰的环状RNA 【8, 10】 。受核酶反式剪接的启发，研究者开发了基于反式剪接的RNA环化技术：TRIC和TERIC 【11】 。经过多轮优化，TRIC在合成1,638 nt的EGFP环状RNA时实现了90.3%的产率，并表现出3.7倍于PIE的环化速率。在抑制共转录环化的情况下，TRIC高效合成了8,706 nt的人凝血因子VIII环状RNA。此外，TRIC和TERIC在环化过程中不依赖于细菌序列，这有助于合成天然环状RNA并减少细菌序列可能引发的免疫原性。TERIC能够合成完全修饰的环状RNA，这可能进一步降低环状RNA的免疫原性，为其长期应用奠定基础。

先前的研究认为天然琼脂糖凝胶无法有效分离环状RNA及其开环产物。本研究发现，在适当的凝胶浓度和运行时间条件下，天然琼脂糖凝胶可以有效分离环状RNA与其开环线性产物。之前的研究可能忽略了这一分离能力，因为常用的1–2%琼脂糖凝胶和较短的运行时间难以区分分子量相近的环状RNA及其开环产物。此外，研究还发现，在琼脂糖凝胶中添加尿素能够缩短分离时间。这种简单、可靠且可调的方法为环状RNA及其线性产物的分离提供了有价值的工具。

研究还测试了环状RNA的蛋白表达效率。研究者优化了一种能够有效降低环状RNA免疫原性的纯化流程。体外表达实验显示，修饰的线性mRNA在第一天的表达量最高，但随后迅速下降；而环状RNA的表达可维持至少七天。TRIC合成的环状RNA还表现出高于PIE环状RNA的表达效率。此外，通过TRIC合成的无细菌序列环状RNA结合病毒CSFV IRES应用于RCT，与单次翻译相比，CSFV-RCT效率提高了11.6倍；与先前的RCT相比，效率提升超过7,000倍。这些结果首次证明了核糖体能够高效读穿高度复杂的病毒IRES，同时暗示未来整合更高效的IRES （如CVB3和HRVB3）可能进一步提高环状RNA的翻译效率。

综上所述，本研究开发了基于反式剪接的RNA环化方法，可合成长度超过8,000 nt的环状RNA。该方法不依赖于细菌序列，效率高于PIE，并能够合成修饰的环状RNA。通过使用病毒IRES进行RCT，研究验证了核糖体能够高效读穿复杂的IRES结构，并显著提升RCT效率。这些技术可能为环状RNA的研究与治疗应用提供有利支持。

杜易飞博士与Venki Ramakrishnan教授在此基础上创立了RNAvate，旨在开发下一代mRNA疗法。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-024-01306-3

参考文献

1. U. Sahin, K. Kariko, O. Tureci, mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nat Rev Drug Discov 13, 759-780 (2014).

2. E. Rohner, R. Yang, K. S. Foo, A. Goedel, K. R. Chien, Unlocking the promise of mRNA therapeutics. Nat Biotechnol 40, 1586-1600 (2022).

3. W. R. Jeck, N. E. Sharpless, Detecting and characterizing circular RNAs. Nat Biotechnol 32, 453-461 (2014).

4. C. X. Liu, L. L. Chen, Circular RNAs: Characterization, cellular roles, and applications. Cell 185, 2016-2034 (2022).

5. C. Y. Chen, P. Sarnow, Initiation of protein synthesis by the eukaryotic translational apparatus on circular RNAs. Science 268, 415-417 (1995).

6. N. Abe et al. , Rolling circle amplification in a prokaryotic translation system using small circular RNA. Angew Chem Int Ed Engl 52, 7004-7008 (2013).

7. N. Abe et al. , Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Sci Rep 5, 16435 (2015).

8. R. A. Wesselhoeft, P. S. Kowalski, D. G. Anderson, Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat Commun 9, 2629 (2018).

9. S. Petkovic, S. Muller, RNA circularization strategies in vivo and in vitro. Nucleic Acids Res 43, 2454-2465 (2015).

10. C. X. Liu et al. , RNA circles with minimized immunogenicity as potent PKR inhibitors. Mol Cell 82, 420-434 e426 (2022).

11. Intermolecular exon ligation of the rRNA precursor of Tetrahymena oligonucleotides can function as 5' exons. Cell , (1985).

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E.N.D