在全球老龄化
人口背景下，诸如骨质疏松症、骨关节炎、骨肿瘤等骨科疾病构成了重大的公共卫生挑战。骨组织不仅包含多种骨细胞，还涉及多种细胞类型之间由多个信号通路调控的复杂相互作用。这种复杂性对骨再生疗法构成了重大挑战，使得为具有不同临床表现的
患者提供个性化和有效护理变得具有挑战性。在此背景下，骨类器官作为一种从干细胞衍生的
3D
自组装结构，模仿了人类骨的细胞多样性和空间组织，为研究疾病机制、开发疗法和实现个性化医疗方法提供了有价值的工具。基于此，来自上海交通大学的苏佳灿、上海大学许可、白龙、井莹莹团队提出了构建骨类器官的通用方法，其通过将骨髓来源的间充质干细胞（
BMSC
）与水凝胶混合，制备仿骨基质的生物墨水，并结合光固化
3D
打印技术
,
成功构建
3D
打印支架。该支架植入体内后可自发矿化和成熟，形成完全分化和血管化的骨组织，为骨骼生物学中的研究和治疗应用提供了新的见解。
首先，作者通过示意图描述了该方法，展示了该生物墨水的制备过程：通过化学反应将明胶、海藻酸钠和羟基磷灰石交联，与
BMSC
混合后，形成了具有骨基质特性的水凝胶，并通过
3D
生物打印技术，打印出了具有方形空隙的圆柱形支架（图
1A-B
）。随后将该支架植入裸鼠皮下，利用体内环境促进骨类器官的成熟和矿化，并通过多种技术对骨类器官的矿化、血管化和细胞分化进行评估（图
1C
）。
接着，作者对该仿骨基质复合羟基磷灰石生物墨水进行了表征。
X
射线衍射（
XRD
）分析显示了其与标准羟基磷灰石图谱相符的特征衍射峰，证实了羟基磷灰石的成功合成。扫描电子显微镜（
SEM
）图像展示了生物墨水中的疏松多孔结构，有利于细胞的长入（图
2B-C
）。能量色散
X
射线光谱（
EDS
）分析显示了碳（
C
）、氧（
O
）、磷（
P
）和钙（
Ca
）的特征峰，表明有机成分和无机成分共存，元素分布图显示了这些元素的均匀分布（图
2E-F
）。
随后，研究者展示了骨类器官的
3D
生物打印过程及其评估结果。通过数字光处理（
DLP
）
3D
打印技术，将生物墨水逐层打印并进行光固化处理，成功构建了预设的多孔
3D
结构（图
3A-C
）。进一步，通过活死染色和细胞骨架染色，评估了骨类器官在体外培养后的细胞活力和细胞形态。结果显示，骨类器官在体外培养后展现出良好的细胞活力，细胞形态完整，细胞间连接紧密（图
3D-E
）。
Micro-CT
扫描显示，骨类器官在培养
20
天和
40
天后呈现出明显的矿化过程。通过不同切面和
3D
全景成像对矿化过程进行观察，观察图像的颜色变化反映了矿化密度的差异。具体而言，培养
20
天后，部分区域开始出现黄色（矿化部分），这标志着初始矿化的形成；而到了
40
天时，黄色区域显著扩大，表明矿化程度有了显著的提升（图
4
）。
作者进一步对骨类器官进行了深入的形态学和结构分析。
SEM
观察结果显示骨类器官具有松散多孔的微架构，并且在内部观察到多种形态的细胞，包括相对圆形的细胞和不规则形状的细胞簇。结合先前的文献进行对比分析，初步推测这些细胞包括红细胞、巨噬细胞和成骨细胞（图
5B-D
）。此外，免疫荧光染色结果显示，骨类器官中
CD31
、
collagen II
和
periostin
高表达，这表明骨类器官在体内培养过程中成功诱导了血管、软骨和骨组织的形成（图
5E-F
）。
作者进一步展示了骨类器官的晶体学和元素分析。透射电子显微镜（
TEM
）图像清晰显示了骨类器官内部的超微结构，表明矿物形成具有良好的结晶度，这对于骨状组织的机械性能和生物学功能至关重要（图
6A-B
）。电子衍射图像进一步揭示了矿化成分的晶体学特征，显示出材料清晰的衍射光环，表明骨类器官中形成了良好的晶体结构（图
6C
）。
EDS
分析显示，骨类器官的元素组成中，钙（
Ca
）和磷（
P
）的特征峰尤为显著，这与骨组织中羟基磷灰石的成分相符（图
6E
）。元素分布图则显示了钙（
Ca
）和磷（
P
）在矿化区域的局部富集，同时碳（
C
）和氧（
O
）的均匀分布也得到了体现，进一步证实了骨类器官中矿化成分与有机基质的结合（图
6F
）。
最后，作者对骨类器官进行了组织学和免疫荧光染色分析以验证其特性。
HE
染色和
Masson
染色展示了骨类器官的整体组织形态、细胞分布以及胶原纤维的排列情况（图
7A-B
）。
ALP
染色和
ARS
染色则突显了该类器官优异的成骨分化能力和较高的矿化程度（图
7C-D
）。
TRAP
染色、
Oil Red O
染色以及
Toluidine blue
染色分别显示了骨类器官中破骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的良好分布（图
7E-G
）。此外，
OPN
和
OCN
的免疫荧光染色结果表明，骨类器官的骨矿化过程活跃且成骨细胞分化成熟（图
7H-I
）。
综上，该研究成功开发了一种结合
3D
打印技术和
BMSC
构建具有矿化能力骨类器官的新方法。通过将
BMSC
与仿骨基质生物墨水混合，并利用光固化
3D
打印技术，成功构建了骨类器官结构。植入体内模型后，这些结构自发矿化并成熟，形成了完全分化和血管化的骨组织。组织学和免疫荧光染色分析进一步证实了骨类器官的成骨分化、矿化程度以及多种细胞类型的分布。该方法为骨骼生物学研究和治疗应用提供了新的见解和有力工具，具有在骨组织工程和再生医学领域的重要应用潜力。
该研究由上海交通大学的苏佳灿教授、上海大学许可、白龙、井莹莹教授团队合作完成，并于
2024
年
12
月
1
日在线发表于
Bioactive Materials
。
论文信息：
Wang J, Zhou D, Li R, Sheng S, Li G, Sun Y, Wang P, Mo Y, Liu H, Chen X, Geng Z, Zhang Q, Jing Y, Bai L, Xu K, Su J. Protocol for engineering bone organoids from mesenchymal stem cells. Bioact Mater 2024, 45: 388-400.
供稿：陆凯
审校：孙亨
编辑：霍娅娅
