为啥发在Cell上的文章,能这么厉害,我也是真服气了,不能整活是真的写不出Cell的。今天讲的中国科学院大学的两位博士生,发表在45.6分的Cell主刊上的。这篇文章虽然说内容上并不太复杂,但他们真的是玩得花,这是一篇秀技术的Cell。他们整个文章的思路,都是通过Cre-LoxP系统,做出来的(不清楚Cre-LoxP的话,建议你们可以先去复习一下《列文虎克读文献》,先熟悉一下大概的原理,再来看这篇文章)。我们就一起来看看他们是怎么做的吧:
他们首先是想分析小鼠衰老过程中,具体哪些细胞发生了细胞衰老这个过程。于是他们构建了一个在p16蛋白后,加上荧光标记的方法(p16和p21这俩蛋白在细胞衰老过程中,占据着比较重要的位置,包括他们后期做的SA-β-Gal的染色,也都是细胞衰老主要的研究方法,还不熟悉细胞衰老信号通路的话,可以去看看《信号通路是什么鬼?》系列)。他们在构建完这个质粒并转染了小鼠的MEF(成纤维细胞),并在传代多次后,分析了具体的细胞衰老情况,以及荧光的表达。并且分析p16-tdT转基因小鼠细胞衰老过程中全身各个组织器官中细胞的荧光表达情况:
有了这样的工具,他们就进行了CCl4诱导的肝损伤模型中,衰老细胞亚群的分析。通过对于肝纤维化损伤后肝脏中,衰老的细胞进行分析,这里就是简单粗暴地直接把所有不同类型的细胞亚群的标志物,和p16-tdT同时进行荧光免疫检测。结果发现在肝脏损伤后,肝脏组织中的巨噬细胞和内皮细胞,发生了明显的细胞衰老。而通过测序和聚类,他们发现巨噬细胞和内皮细胞,虽然都会产生衰老,但所产生SASP并不一样(这也是细胞衰老过程中,衰老相关分泌表型,这个可以去看看《信号通路是什么鬼?》复习下)。衰老的p61+巨噬细胞中,炎症反应、趋化性、细胞外基质组织和细胞衰老表达上调。衰老的p61+内皮细胞的包括炎症反应、T 细胞增殖的正调控都有上调,而DNA修复、血管新生等通路相关基于表达下调:
接下去他们就要秀操作了,他们的目的是为了在肝损伤的过程中,用荧光标记显示出衰老的巨噬细胞和内皮细胞。于是他们就构建了个很复杂的体系。一方面分别用内皮细胞启动子和巨噬细胞启动子,表达Dre和DreER(Dre和Cre差不多,也是重组酶,加了ER的话,就是雌激素受体诱导,可以切掉rox序列,这个和Cre酶重组切掉LoxP序列差不多);另一方面,使用p16启动子过表达CreER。这样的话,雌激素诱导后,在p16+的巨噬细胞和p16+的内皮细胞中,就会表达大量的Dre和Cre重组酶。同时小鼠中也转入了GAG启动子接的荧光蛋白,而在启动子中,具有两个终止序列,分别是有rox序列和LoxP序列的。当表达Dre和Cre重组酶后,终止序列被切除,就会显示荧光了:
结果发现在肝损伤后,肝组织周围的巨噬细胞中荧光蛋白亮了。这也就说明巨噬细胞可能对于肝损伤有一定的刺激作用。那么如果清除这样的衰老巨噬细胞呢?他们又整活了。和刚才表达荧光的思路差不多,他们在同时表达巨噬细胞标志物和p16的细胞中,表达了DTR(白喉素受体,这个方法其实可以理解为把刚才的荧光标记替换成了DTR),这样只要再加入白喉素,就能轻松杀死细胞。在CCl4诱导肝损伤后,他们用白喉素清除了p16+的巨噬细胞,结果发现清除了p16+的巨噬细胞(这其实就是柯霍氏法则的验证,通过清除某个关键因素,查看对于表型的影响,不清楚柯霍氏法则的话,可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑:从实验台到咖啡桌》),肝纤维化损伤的标志物表达下调,也就是说肝损伤缓解了:
接着,他们又用同样的方法,在诱导肝损伤后,清除了p16+的内皮细胞。结果发现p16+的内皮细胞清除后,肝损伤后肝脏纤维化转而变得更严重了:
通过分别清除p16+的巨噬细胞和p16+的内皮细胞,然后进单细胞测序,以此来分析NPC(肝非实质细胞)细胞所受到的影响。在进行聚类后发现,清除了p16+的巨噬细胞后,T细胞的增殖和分化相关产生了明显的增多。而p16+的内皮细胞清除后,间充质细胞的增殖和呈现为细胞活化明显增强了:
他们发现VEGF信号通路中(这个信号通路在血管生成和肝脏修复中,都有关键的作用,不熟悉VEGF信号通路的话,可以去看看《信号通路是什么鬼?》系列,复习下)的关键受体KDR,在p16+的内皮细胞中明显下调。于是他们……他们就又整活了,他们把之前那个DTR给替换成了KDR+荧光蛋白。也就是特异性地在p16+的内皮细胞中,过表达了KDR。结果发现,通过这样过表达KDR的重编程后的p16+的内皮细胞,可以有效缓解肝损伤后的肝纤维化:
这篇文章,看完你会发现,这简直就是给你在复习Cre-LoxP系统的使用方法。机制上虽然没咋深入,但技术上那真的不是盖的,我看得眼花缭乱的。好了,今天就先策到这里了,有兴趣的话可以看看原文,祝你们心明眼亮。
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