单基因遗传病是一种对患病家庭影响非常大的疾病，人群发病率可达
1%
，全球每年有
135
万患者出生，这类疾病的诊断和治疗非常复杂，大部分患者都得不到明确诊断。随着二代测序技术的发展，特别是全外显子测序的应用，单基因遗传病的致病原因寻找有了有力工具，相比传统方法诊断率有了很大的提高。全外显子测序的早期应用可以避免侵入性检查，缩短诊断周期，更有性价比。然而到底是全基因组测序（
WGS
）还是全外显子测序（
WES
）更有性价比，目前没有定论，不可否认的是，全基因组测序有检测拷贝数变异（
CNV
）的技术优势，就是价格太贵阻止了临床的应用。
据说重新分析全外显子测序数据可以提高未确诊案例的诊断率，但是究竟什么时候重新分析好像还没有讨论，因此我们对澳大利亚
54
名疑似单基因遗传病患者进行重新分析，以评估临床有效性及重分析的价值，希望我们的经验对大家有所帮助。
案例收集
2013
年
7
月到
2014
年
7
月临床遗传门诊收集的患者，入组条件包括：临床表型疑似单基因遗传病、有遗传病家族史、有父母
DNA
可以验证、签署知情同意书、未确诊。
变异过滤与筛选
首先根据家族史进行位点筛选，每一种遗传模式都进行了考虑。去除正常人群频率中高于
1%
或者
GEMINI
软件预测对蛋白影响较小的变异位点，分析新发突变时，只考虑那些患儿携带而父母未携带的位点。候选位点进一步使用
SIFT
、
PolyPhen2
，
PROVEAN
与
CADD
进行筛选。
12
个月后重分析
在初次分析阴性的
case12
个月后重新分析，之所以选这个时间周期是考虑临床表型的增加以及基于临床遗传重新审阅周期。生信流程的改变包括
GEMINI
和
GATK
。并使用界面化的
GEMINI
软件
SEAVE（www.seave.bio）
来进行位点筛选。
结果
37
个患者中有
11
名得到了诊断，先证者表现各异，其中一半是复杂型智力障碍，剩余病例包括骨科、肝脏、神经、代谢的。
13
个家庭使用了
trio
测序策略，
9
个家庭只对先证者检测，如果家庭中有多个患者，一般是患者进行
WES
测序。从诊断率来看
trio
达到
46%
（
6
个家庭）而先证者为
22%
（
2
个家庭）。
12
个月后重分析
重新分析后又有
4
例得到明确诊断，从而使整体检出率从
30%
提高到
41%
。其中两例是因为科学发现新的基因与临床表现有明确相关性，
1
例是在剪切位点附近，因为更多的家系共分离验证与功能实验，还有一例是生信流程的改进，通过合并
calling
提高了检测的灵敏度。
讨论
随着时间的推移，有更多的基因与临床表型被确认，更完整的临床表型被收集，更先进的分析算法，这些都要求对原始数据进行重新分析，有助于提高临床检出率。临床遗传学家与本地测序数据库可以大大地减少待筛选位点，通过
trio
测序可以更多地排除待筛选位点。
我们的经验是多学科的会诊对于评估变异致病性非常关键，会诊人员包括临床遗传师、遗传咨询师、遗传病理师、科研人员。
