病毒载体开发、生产和工艺强化

来自Janssen Vaccine疫苗工艺开发组的 Edwin Janssens 描述了一种试验设计 (DoE) 方法，这种方法采用Sartobind 膜层析来纯化病毒疫苗。

他解释道采用质量源于设计 ( QbD ) 的方法与监管预期相一致，因为其不仅降低了对最终产品测试的依赖，而且也是生产企业形成工艺知识的一种明智之举。

Janssen Vaccines采用 QbD 方法来表征其一些基于载体的产品的工艺。将其中一种SSB Sartobind 膜层析用作纯化工艺的一部分。Janssen Vaccines在一种结合洗脱模式中使用该层析膜，因为该公司某些基于载体的产品带负电荷。Sartobind系列的膜还有一些小型膜，借以改进DoE方法——只需要少量的实验物料就可进行大量的实验。

Janssens解释道生产企业首先应采用 QbD 工艺，并进行风险评估，以减少必须要筛选的条件数量，并且不排除可能影响产出曲线的参数。成功进行风险评估可以设计出筛选实验，以及研究的参数范围。同时生产企业还必须根据其控制策略和其他因素来决定至关重要的参数的构成。科学家用于分析结果的统计软件可以将参数识别为重要参数，但生产企业应确保这些参数是否对该制定提供科学依据。在随后的增强试验设计中，可以将被视为不具有重要性或重要性最低的因素排除，以在要了解的关键参数之间实现可能的互动。生产企业可以根据增强试验设计结果来确定经证明可接受的关键工艺参数范围和材料属性。 Janssens总结道， QbD 方法要求实验人员具有创造力，并且要求在整个工艺过程中做出选择。获得的有关这一工艺的大量知识使得这种方法值得努力去研究。

Amélie Boulais（SSB疫苗平台营销经理）认为产品组合的可扩展性很关键。

研讨会期间讨论了病毒载体生产强化的需求。Felipe Tapia（来自德国马格德堡Max Planck Institute研究所）就作为Ing.Udo Reichl教授博士生物工艺工程组开展的科学活动一部分的强化和连续疫苗生产工艺发表了演讲。他认为基因疗法行业需要使用工艺强化方法来充分发挥其要求的高剂量投入的潜能。要达到非常高的滴度和实现充分的载体数量，需要付出大量努力，并且在临床3期试验和商业生产过程中要求进行非常仔细的工艺优化。 Tapia解释道疫苗生产企业应考虑是否以批量、半连续或连续模式进行生产。试图摈弃传统批量生产的公司需要确保在工艺强化过程中保持细胞特异病毒产率、病毒质量以及稳定性。

由Yvonne Genzel博士领导的Max Planck Institute研究所上游工艺团队使用灌注来增加感染前生物反应器中细胞的浓度。一个有趣的发现就是膜截留率越大的过滤阻挡装置在生物反应器内截留的病毒越多，这可能是由于中空纤维膜的污染现象引起的。该团队表明ATF系统可以用作阻挡装置来强化甲型流感病毒生产期间的细胞培养。 通过这一设置，细胞浓度的增大并未降低细胞特异病毒的生产率，因此使得滴度增加了14倍，容积生产率增大了2倍，细胞特异病毒生产率增大了2倍。

Tapia和他的同事还采用多阶段生物反应器进行流感病毒连续生产的试验。采用一台搅拌罐生物反应器来进行细胞培养，同时采用另一台或两台搅拌罐生物反应器来进行病毒感染和生产。向每一台生物反应器中灌注新鲜培养基，并连续收集病毒产品。该团队发现尽管这对基因稳定的病毒来说是一种高效的生产系统，但如果缺陷干扰颗粒累积，滴度可能会长时间发生振荡。此外，病毒传代的增加还可能会导致有害的病毒突变。

为了解决这些问题，该团队开发了一台推流式生物反应器，可以恒定供应具有确定传代次数且无滴度振荡的病毒。搅拌罐反应器作为恒化器运行，连续不断提供细胞。该系统可感染这些细胞，并在细胞进入推流式生物反应器之前，将气泡注入到培养基中。气泡可以为随后的病毒复制阶段提供足够的氧气。来自Max Planck Institute研究所的工程师们将这种方法用于悬浮MDCK细胞，这些细胞通过100m长的反应器用了大约20个小时的时间。该第一个反应器原型中的流动方式为层流，内径1.5 mm，流速为12 mL/h。 该团队预计疫苗生产企业用一台50L反应器以1.2L每小时的速度可在35天内获得1000L的病毒收获液。

为了支持生物制药行业尝试强化生物工艺，SSB投入了大量新技术。许多技术都适用于病毒载体行业，其中包含各种开发工具，如带有全新离心插件、可作为灌注模拟操作的ambr 15，以及可通过多达24个生物反应器并行操作开发灌注工艺，进行全自动液体处理的 ambr 250 高通量灌注系统等。Gerben Zijlstra（SSB连续生物生产平台营销经理）描述了公司的工艺规模技术，其中包括带有整体式细胞分离过滤器，用于n-1灌注的摇摆式生物反应器，以及用于获得高细胞密度培养液的kSep离心机。他解释道客户曾经使用快速循环的膜层析来简单有效地实现高生产率。

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