蛋白研究始终处于生命科学领域核心地位，发现「核心」关键蛋白是开展研究的第一步，而蛋白功能验证及通路分析是研究的重头戏。Co-IP 是蛋白功能研究，寻找互作蛋白的主要方法，但实际进行 CO-IP 实验时，各种问题层出不穷—Co-IP 看不见条带、非特异性条带、对照有误、纯化介质选择不当、抗体污染……
针对上述问题，如何排查原因并且有针对性的优化？Co-IP 实验对照的设置有哪些要点，结果如何解读？作为入门者，如何选择合适的蛋白组检测方法，进而发现目标蛋白？为了更好地解决大家的实验困惑，赛默飞世尔科学技术专家联合丁香园，于 10 月 24 日 14 点开展线上讲座《聚焦「核心」蛋白：差异化蛋白鉴定与功能分析》，本次直播会从定量蛋白组学检测与分析、Co-IP 技术与结果分析、常见问题及优化到研究案例分享，逐一讲解，干货满满！
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定量蛋白组学方法可以全局化、高通量地对不同样本中的差异化蛋白进行发现并定量，为下游筛选相关通路中的关键蛋白提供信息。我们将讲解常见定量蛋白组学方法和多重蛋白定量金标准，尤其新一代 TMTpro 32plex 技术,可扩展至 35 标，同时标记 35 个样品，将实现更大的覆盖深度、更好的实验控制和通量。
二.「核心」蛋白功能研究经典策略：Co-IP
Co-IP 实验是目前研究蛋白互作最常用的手段。我们将从 Co-IP 实验原理、技术流程、固相介质和抗体的选择及其对实验的影响、结果解读到常见问题分析及优化等方面系统解析实验要点/难点，助力蛋白功能探究。基于此，我们精心准备实验指南和问题分析手册供大家随时参考学习，报名即可在直播当天领取。
● 如何进行 Co-IP 对照设置
● Co-IP 无信号的情况及优化
● Co-IP 高背景的原因及解决
● Co-IP 实验如何去除抗体轻重链的影响
更多详细内容，大师姐将会在此次直播中为各位讲师更多的宝贵经验，为大家的蛋白研究保驾护航！
在实际开展免疫沉淀实验的过程中，会遇到多种技术和实验问题，也有许多实验细节需要掌握。根据多年实战经验，精心总结实验流程、影响因素、问题分析及解决方案等，免疫沉淀实验指南和问题分析手册方便大家个性化、针对性的优化实验。
一、免疫沉淀实验影响因素分析：
无论是固体介质类型、抗体固定方法、加样顺序还是结合/洗涤/洗脱缓冲液，任何变量的改变都对实验结果至关重要。以固体介质（支持物类型）为例，实验常用琼脂糖和磁珠的选择有何讲究？
1）交联的琼脂糖是 IP 应用中最常用的微珠支持物。琼脂糖具有更高的结合能力，且性质稳定， 不会受中等含量的多数去污剂、盐、大多数有机溶剂或极端 pH（pH 长期耐受范围为 3～14，不会被大量水解）等条件的影响。
2）磁珠是近几年来颇受欢迎的 IP 固相支持物。因为具有磁性，无需离心，只要配合磁力架使用，即可完成对固相和液相的分离。具有快速、温和、可重复性高以及非特异性低的优势，适用于高通量，自动化分析。但由于磁珠表面积小于琼脂糖珠，单位体积的结合能力会低于琼脂糖树脂。
3）交联的丙烯酰胺/双丙烯酰胺树脂是琼脂糖微珠的常见替代物，具有如耐受微生物污染、良好的化学和 pH 稳定性以及非特异结合低的优势，但机械稳定性一般。
二、常见问题及解决方案
1）抗原结合水平低：
IP 应用中出现低抗原结合水平的可能原因有很多，结合反应所使用的溶液是重要原因之一。必须使用适合的缓冲液，有特定的 pH 和盐浓度，可能还需要添加互作所需的辅助因子。
IP 或 Co-IP 中用于纯化的抗体是影响得率的另一个重要因素。尽量选择稳定、结合力强且经验证过的抗体。Invitrogen 高级验证抗体经过至少一种方法（基因敲除或敲低，IP-MS，细胞处理等）验证，保障与靶标正确结合。
2）抗原洗脱水平低
在某些情况下，抗原与抗体或结合蛋白结合之间可能会发生极强的相互作用，传统的洗脱缓冲液无法将其破坏。如果抗原产量很低且怀疑抗原仍然结合在微珠支持物上，解决方案如下：用剧烈的缓冲液 ( 如 SDS-PAGE 上样缓冲液 ) 来煮沸少量微珠，然后离心微珠，再采用 SDS-PAGE/蛋白质免疫印迹分析上清，确认上清是否存在抗原。如果存在抗原，则应尝试其他强度更高的洗脱缓冲液，以确保抗原不会被灭活的洗脱条件。
1）非特异性蛋白污染：
如果洗脱所得抗原纯度较低，则有几种方法可以进行优化：①在结合或洗涤缓冲液中加入去污剂或其他可以降低非特异性结合的组分。②使用普通微珠预纯化样本。③使用无关蛋白 ( 如 BSA）封闭微珠 。④使用温和的缓冲液。
2）抗体污染：
使用蛋白 A、G 或 A/G 的经典免疫沉淀实验中会出现抗体与抗原共洗脱的情况。如果共洗脱会影响下游分析，则需要使用抗体通过共价连接固定至微珠的方法进行实验。
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注：以上所有奖品预计将于 11 月中旬陆续发出。
