从实验室走向临床——MSCs临床应用转化路径
在一个干细胞与终末期肝病的学术会议上，我听到2个截然不同的干细胞治疗肝病的研究报告。一个研究小组的治疗结果非常好，自体外周血干细胞治疗终末期肝病，无论是对患者的症状改善，还是对终末期肝病患者的生存时间及生存质量都有较好的临床结果。该项研究由于其在治疗终末期肝病中开拓了创新性的治疗方法，及为患者的生存质量带来了显著性改善的社会效益，获得军队成果奖项。但在会议中同时获邀做学术报告的另一个研究小组报道的结果却是无效的。而近期，美国最早获得FDA批准进入临床研究的Prochymal（来源于人骨髓的间充质干细胞）先后宣布了3项临床研究失败（fail to reach the primary endpoints），其中2项是Prochymal 治疗GvHD的III期临床研究，一项是治疗COPD的II期临床研究。该公司的Prochymal治疗GvHD的II期临床研究结果非常好，III期临床研究却失败了。为什么呢？我不禁想起4月底在北京召开的一个干细胞管理法规研讨会中，许多与会专家纷纷讲述自己的临床实际经验及干细胞临床应用的良好前景，但也有几位专家提到干细胞治疗在临床中并没有太好的临床疗效，正在大家各执己见之时，另一位专家指出：“干细胞的临床疗效不像药品，只要选择对的适应症，配合对的治疗方案，就会获得很好的临床效果。有一点不容忽视，干细胞是一种活的、动态的细胞，它良好的临床疗效不仅需要像药品那样选择对的适应症和对的治疗方案，干细胞的制备、培养方法和干细胞的来源选择也是保证其临床疗效的关键因素，甚至是培养液的不同都会对临床应用疗效产生影响。”我想这大概就是上述干细胞治疗特定疾病时获得不一致临床疗效的关键要领了。
因此，干细胞疗法从实验室走向临床就需要建立一个新的、完全不同于化学药品的、可能更为复杂的临床转换体系。在此以间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，以下简写为MSCs）临床转换为例，试图为构建干细胞研究从实验走向临床的转换体系绘制一条可能的路径。
1、MSCs的不同组织来源与生物学特性
MSCs是一类具有多项分化潜能、低免疫原性的成体干细胞，具粘附性，呈纺锤型、成纤维细胞样形态，但不同的组织来源及培养方法的不同会产生不同形态的MSCs[1]。其广泛地存在于人体的骨髓、脂肪、牙周膜、新生儿的脐带、胎盘、羊膜、羊水等组织中[2]。从细胞表型特征来看，目前并没有发现MSCs有某种特异性的细胞表型标记，而通常认为MSCs不表达造血干细胞的表面标记如CD45，CD14，CD11，及一些共刺激分子如CD80，CD86，CD40和CD31。一般认为MSCs表达CD105，CD73，CD44，CD90，CD71，CD106，CD29等。与其形态学特征类似，不同组织来源的MSCs细胞表面标记会略有不同[3]，如骨髓来源的MSCs不表达CD34，但人体脂肪组织来源的MSCs则表达CD34。而表面标记的不同则可能会影响到MSCs的生物活性，如迁移能力、归巢性、分化潜力及可塑性等。一项研究[4]比较了人骨髓来源、胎盘来源及脐带来源的MSCs，发现这三种不同来源MSCs的迁移及归巢能力存在较大的差异，进一步研究表明，这三种不同来源MSCs的细胞表面存在6种与迁移、归巢能力相关的蛋白表达差异。而MSCs的这些生物特性都与其临床疗效直接相关。这是由于MSCs的微环境为血管外膜细胞[2]，可在炎症部位释放大量的生物活性因子，发挥营养作用及免疫调节作用。而并不是所有的血管都一样，故而血管外膜细胞也不尽相同。既然调控MSCs发挥应答及生物活性作用时，不同组织来源的MSCs会有所不同，那在治疗不同的疾病时是否需要考虑选用不同组织来源的MSCs呢？
2、培养及制备方法
目前研究表明，MSCs的作用可能并不是用来替代受损的间质组织，其最基本、最重要的作用可能是抑制“免疫监控”及创造一个有利于受损组织修复再生的微环境[1]。这种效应的达成是通过细胞因子的分泌及“细胞与细胞直接接触”获得的。因而一些会影响到MSCs活性的变量因素也就可能会影响到临床疗效，如细胞的分离培养方法、传代次数、细胞的运输方法及路途[5]等。在Osiris宣布Prochymal（体外培养的人的骨髓间充质干细胞）的临床研究失败后，一位参与该项研究的专家评论[6]说，“Osiris从成人的骨髓中提取、分离、扩增制备成MSCs，应用到临床中的Prochymal通常培养超过5代。过度的培养可能是令Prochymal失效的原因所在。” 而另一方面，参与Osiris Prochymal III期临床研究的中心有52个，分布在美国，加拿大及澳洲（另一项研究是72个中心分布在美国，加拿大，欧洲及澳洲），每个中心的病例数相对较少，而临床研究讲求细胞来源的同一性，同一个供体来源MSCs分散到散落的各个研究中心。“等待的时间越长，GVHD治疗的难度则越大”。这提示我们，批量制备好的细胞在到达研究的各个中心所需的运输时间对临床疗效亦会产生影响。一项关于MSCs制备生物活性保存的研究[7]提出，MSCs作为一种细胞疗法应用于临床中时，需要储存于一定的溶液中便于运输并保存其生物活性。研究证明，不同的制备方法、不同的保存溶液、不同的保存温度，以及运输（制备好的细胞到达医疗机构）时间都会对MSCs的生物活性、细胞表面标记及分化潜能产生影响。如冻存-复苏后的MSCs在Plasmalyte A（勃脉力）液中，其细胞活性、细胞表面标记的表达及分化潜能在4摄氏度下可维持2个小时不受影响；而新鲜制备的MSCs在4摄氏度下，可以在同样的保存液中保持上述指标90%有效性 [7]达6小时。该研究还证明，在同样的温度及其他条件（制备方法）下，不同的保存液也会影响到MSCs的生物活性、细胞表面标记及分化潜能。因此在干细胞疗法临床应用产业化转换过程中，上述各个环节的标准化，以及在实验室制备到临床应用的合理运输半径内设置区域中心实验室[7]，对于MSCs临床疗效的保证非常关键。
3、治疗时机及给细胞途径
MSCs的临床疗效也会受到治疗时机及给细胞途径的影响。通常认为，在损伤/炎症发生急性期及时给予MSCs，可以发挥其“旁观者效应”[1]，改善损伤/炎症部位的微环境，减少细胞凋亡，并促进受损器官祖细胞的增殖分化[1]，而这就向MSCs临床应用产业化转换提出了挑战，需要提前制备并储存供临床应用的具有生物活性的MSCs。当然，我们也注意到有文献报导，在损伤/炎症急性期给MSCs会加重炎症反应[8]，这可能与给细胞途径有关。一项有关脂肪间充质干细胞丰胸的研究[9]发现，局部进行脂肪移植，随后局部注射分离的脂肪MSCs，在接下来的观察随访期，受试者注射局部会发生纤维化，但接受MSCs与脂肪组织混合后同时注射的受试者，在随访期却未发现注射局部纤维化的情况。这可能是由于局部注射脂肪组织后形成了炎症环境，此时再在同一部位给予大量的MSCs会加重炎症损伤，炎症/缺血的微环境会刺激MSCs的成纤维化转化。因此，在损伤/炎症急性期采用系统性给细胞，如静脉输注的方法，可能较为合适[10]。因为炎症/损伤急性期，会有大量的炎症信号释放，系统性方法所输注的细胞会受到炎症信号的“吸引”向炎症部位趋化，而不会因为局部给细胞的途径而导致大量MSCs“聚集”在炎性部位，与炎症微环境相互作用从而发挥“非治疗初衷的效应”。另外，结合MSCs生物学特性，制定完整有效的治疗方案也对其临床疗效有着重要的影响。如炎症/损伤急性期采用系统性给细胞，但随着炎症/损伤后期炎症信号的减弱，是否可以考虑结合局部给细胞以加强临床疗效？[10]。
结论与展望
干细胞疗法要从实验室走向临床，解决有需要患者的问题，提高一些难治性疾病如GVHD、终末期肝病等的临床疗效，不仅仅需要如化学药品一般的要求，只要做到合格的生产规范，选择合适的适应症，即可获得近似的临床疗效。干细胞由于其活细胞的生物学特性，要获得良好的临床疗效不仅需要考虑选择合适的适应症，最佳的细胞类型，适合的细胞制备、储存方法及运输时间、方式，也需要考虑给细胞的最佳时机和途径等诸多变量，这些因素都在约束、影响着干细胞的临床疗效。这就需要建立一个全新的、不同于化学药品的转换平台，以尽可能控制干细胞从实验室走向临床的每个环节中的关键变量，如干细胞采集、分离、制备、储存等操作过程的标准化，如储备临床治疗所需的不同组织来源的干细胞。我们既要保证临床治疗需求的及时性，又要考虑最大化保存干细胞活性的制备中心辐射范围及运输路径，同时，也需要保证生产的规模化及生产过程的全面质量监督管理。这就需要设置干细胞库，一是可以从源头上控制应用到临床的种子细胞的可控性，另一方面可以保证临床所需干细胞的丰富性和多样性；同时也需要设置辐射一定区域内医疗机构的细胞处理中心实验室（central processing laboratory）[7]。目前中国江苏省设置的江苏省干细胞与生物治疗公共技术服务平台为我们提供了建立基于干细胞生物学特性的临床转换平台的新思路与新探索。
干细胞疗法的临床应用是一个全新的转换医学平台构建的过程，而这种平台构建必须要建立在对干细胞的活细胞生物学特性及干细胞疗法的“个体化治疗模式”认知的基础之上。最后，借用参与Osiris III期临床研究的那位专家在该项研究宣布失败后的评论作为结束语：“我们不应将Prochymal 此项研究的失败与其它的MSCs治疗联系起来，因为所有的MSCs均不是同一性的，不同的培养方法可能会产生不同的效应”[6]。故而，丰富的组织来源干细胞储备，标准化的制备流程，合理的运输半径及规范的诊疗指南对干细胞疗法的临床转换至关重要。
参考文献
1. Uccelli, A., L. Moretta, and V. Pistoia, Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol, 2008. 8(9): 726-36.
2. Caplan, A.I., Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. J Pathol, 2009. 217(2): 318-24.
3. Gimble, J.M., A.J. Katz, and B.A. Bunnell, Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res, 2007. 100(9): 1249-60.
4. Guo Li, ,Xiao-ai Zhang, Hua Wang et al. Comparative proteomic analysis of mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, umbilical cord, and placenta: Implication in the migration. Proteomics 2009, 9: 20–30.
5. Robert E. Newman, Dana Yoo, Michelle A et al. Treatment of Inflammatory Diseases with Mesenchymal Stem Cells. Inflammation & Allergy - Drug Targets, 2009, 8:110-123.
6. Allison, M., Genzyme backs Osiris, despite Prochymal flop. Nat Biotechnol, 2009. 27(11): 966-7.
7. Pal, R., M. Hanwate, and S.M. Totey, Effect of holding time, temperature and different parenteral solutions on viability and functionality of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells before transplantation. J Tissue Eng Regen Med, 2008. 2(7): 436-44.
8. di Bonzo LV, Ferrero I, Cravanzola C, et al. Human mesenchymal stem cells as a two-edged sword in hepatic regenerative medicine: Engraftment and hepatocyte differentiation versus profibrogenic potential. Gut 2008; 57: 223.
9. Yoshimura, K., et al., Ectopic fibrogenesis induced by transplantation of adipose-derived progenitor cell suspension immediately after lipoinjection. Transplantation, 2008. 85(12): 1868-9.
10. Chamberlain, G., et al., Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells, 2007. 25(11): 2739-49.
（来源：mscs的新浪博客 2010-03-05 ）
