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Increased Transmission of Antibiotic Resistance Occurs in a Soil Food Chain under Pesticide Stress

农药胁迫下土壤食物链中抗生素耐药性传播增加

通讯作者：乔敏 副研究员 中国科学院生态环境研究中心

抗生素抗性已经成为全球健康威胁。尽管微生物的抗性是一个自然现象，但自20世纪40年代以来，人类对抗生素的增加使用大幅增加了人类、动物和植物系统中的抗性。现在自然界中普遍存在编码不同抗性蛋白和机制的多种抗生素抗性基因（ARGs），它们在包括土壤环境在内的“同一健康”领域内被传播和扩散。土壤拥有地球上最多样化的自然进化ARGs； 然而，抗生素抗性在土壤生态系统内的传播和扩散，特别是在土壤动物中，仍然知之甚少。这一理解对于开发解决这一全球健康挑战的整体解决方案至关重要。

土壤动物在土壤生态系统中的基本生态过程中扮演着关键角色，它们的肠道微生物群已被报道为ARGs的主要储库。人为压力，如重金属、抗生素、和纳米颗粒污染，已经条件性地导致ARGs在土壤生物中的进一步积累，但关于生态现象如何影响土壤生态系统中ARG传播的了解仍然很少。例如， 捕食者-猎物关系是土壤生态系统中的一个主要组成部分。 研究表明，抗生素和纳米颗粒可以通过土壤食物链以及跨营养网络的微生物移动，与它们的宿主和彼此相互作用。 然而，在食物链中，ARGs从猎物到捕食者的具体转移尚未被深入研究，特别是在农药等其他污染物存在的情况下。

农药在土壤生态系统中被广泛使用以控制害虫并防止作物受到侵入性感染，并且有证据表明它们或它们的分解产物有助于获得和传播抗生素抗性。不同的机制已被提出。例如，农药暴露可能会调节某些微生物对抗生素的敏感性，并可能加速水平ARG转移的移动遗传元素（MGEs）的速率。或者，农药可能对敏感菌株施加选择压力，从而改变微生物群落对抗生素的抗性水平。例如，已经显示卡宾达唑通过增加某些细菌属的丰度，增加了土壤细菌群落对氯四环素的抗性。然而， 在农药暴露下土壤动物或它们的食物链中的微生物选择和ARG流行仍然不清楚。

在这里，我们研究了噻唑锌（ZT）暴露对跳虫肠道抗性组和微生物组的影响，以及一个相关的模型食物链，包括作为猎物的孤雌生殖跳虫Folsomia candida，以及作为捕食性螨虫Hypoaspis aculeifer，这是跳虫的典型土壤捕食者。 选择ZT是因为它的高效率和低毒性，并且已经显示它影响土壤微生物活动。 选择跳虫-捕食性螨虫猎物-捕食者对是因为这个模型经常在生态毒性测试中使用。使用高通量定量PCR（HT-qPCR）和16S Illumina测序分别量化肠道抗性组和微生物组。我们在这里做了以下工作： 1）量化了不同ZT压力下跳虫肠道微生物组和抗性组的变化；2）检查了食用ZT暴露的跳虫对捕食性螨虫肠道微生物组和抗性组的影响；3）梳理了这个食物链中ARGs的可能驱动因素。 我们假设1）ZT暴露将改变跳虫肠道微生物组和抗性组；2）ARGs和MGEs可能通过捕食从跳虫微生物组转移到捕食性螨虫微生物组。

4. Discussion

4.1. ZT Exposure Enhances the Relative Abundance of ARGs in Collembolan Gut Microbiomes

农药的施用日益增加，并在土壤中频繁被检测到，这可能会对土壤中原有的微生物群落造成压力。然而，由于之前没有研究评估过ZT暴露对跳虫的生态毒性效应，因此我们将跳虫暴露于低至高的ZT剂量下，并参考了之前的研究。在跳虫中没有观察到死亡率或繁殖力的显著变化，然而抗生素抗性基因（ARGs）的选择以及它们肠道微生物群的多样性和组成对ZT暴露水平敏感。 正如我们所假设的，增加的ZT暴露显著增加了跳虫微生物群中某些ARGs的丰度。 这与最近一项关于蚯蚓肠道的研究观察结果相似，在1.0 mg/kg ZT暴露下，一些ARGs比对照生物增加了4.5至6.3倍。 他们和我们的研究结果暗示，ZT暴露可能普遍促进了土壤动物肠道微生物群中ARGs的富集。 我们的结果还显示，随着宿主的发育，跳虫肠道微生物群中的ARGs和移动遗传元素（MGEs）的数量也在增加，这可能是由于肠道微生物群的群落变化。同时，ZT暴露导致跳虫微生物群的细菌多样性下降，这与其他关于无脊椎动物肠道微生物群的研究结果一致。最近的一项研究表明，ZT可以丰富土壤无脊椎动物肠道微生物群中特定的代谢途径，如柠檬酸循环。 尽管ZT因其高效和低毒性而受到认可，但它可能会无意中改变肠道微生物群的群落组成和功能，进而导致微生物群中ARGs丰度的变化。 此外，MGEs丰度的变化（包括质粒和整合子）与细菌群落的组成和结构都与跳虫肠道样本中ARGs的富集统计相关。先前的工作强调了MGEs在改变ARGs谱中的重要作用，支持了水平基因转移是在ZT压力下ARGs富集的关键机制的观点。 简而言之，我们的研究结果表明，在ZT压力下，跳虫肠道微生物群中ARGs的富集增加，MGEs可能介导了抗生素抗性的选择。

4.2. Trophic Transfer of ARGs in the Food Chain

由于ZT暴露导致跳虫肠道微生物群中ARGs的富集，我们进一步研究了食物链中跳虫及其捕食性螨虫肠道抗性组的Trophic Transfer（营养转移）情况。然而 ，跳虫和捕食性螨虫之间固有的ARGs组成存在显著差异 。先前的土壤食物网研究也显示了ARGs在不同物种中的强选择性，表明在多样的肠道环境中ARGs的选择。在我们的研究中， ZT压力下跳虫和捕食性螨虫中富集的不同基因可能归因于它们抗性组和微生物组的固有差异。此外，这些差异可能导致不同的应对压力策略，导致不同的适应和基因富集模式。

我们发现，在ZT处理的跳虫和捕食性螨虫中选择了许多独特的ARGs，但对照捕食性螨虫中排除了这些ARGs（图2b）。这表明捕食性螨虫中的一些ARGs可能源自跳虫中的ARGs，进一步表明ARGs可能随着捕食行为从跳虫转移到捕食性螨虫，显示出抗生素抗性可能通过土壤食物网的营养转移发生。对于猎物和捕食者之间ARGs的转移和选择，有两个潜在的机制解释。首先，当捕食者摄入携带ARGs的猎物肠道细菌时，它们可能在捕食者肠道中被选择并存活下来，尽管在ZT压力下这种选择的具体驱动因素仍然不清楚。其次，ZT压力下ARGs的水平转移可能被促进，因为螨虫的肠道细菌从它们的猎物中获得MGEs和/或ARGs，从而有助于捕食者中抗性组的发展。 为了更好地理解ZT内部选择在两个肠道微生物群中的作用，测量猎物和捕食者内部ZT浓度将提供宝贵的见解。 一些ARGs，如tetA(P)、aacA43和tetG，在食用ZT暴露的跳虫的螨虫中显著富集。AacA43特别值得关注，因为它编码的基因盒赋予了对卡那霉素、妥布霉素和一些氨基糖苷类的临床相关抗性。AacA43在另一项关于生菜和蜗牛的食物链研究中被提及为重要，表明通过这个基因盒ARGs的营养转移在土壤食物链中可能很重要。

在捕食性螨虫的微生物群中检测到并富集了丰富的多药耐药基因，可能来自猎物跳虫。多药耐药泵被报道能够排出包括传统抗生素、农药和重金属在内的各种有毒化合物。通常，多药耐药主要与非特异性抗性机制相关。然而，这表明正在选择赋予广谱抗性的基因，这增加了抗性在更高营养级别发展的可能性。在更高营养级别的无脊椎动物被报道拥有更高的微生物多样性，并参与更广泛的活动。捕食者的改变和扩大的抗性组表明，通过土壤食物链的ARGs传播有助于抗性向更高营养级别传播，我们的研究表明，在农药压力下这一过程被放大。因此， 抗性组可能随着捕食行为进一步转移到食物网中的更高营养级别，并可能伴随着无脊椎动物的行为或活动传播到多样的生态系统中。

4.3. Possible Drivers of ARG Transfer

4.4. Microbiomes in the Soil Food Chain

4.5. Potential Pathogen Hosts of ARGs

细菌病原体是人类和生态系统健康的核心关注点。因此，它们在任何生态系统中的传播都是一个问题，特别是人畜共患病原体，它们可以相互影响人类和动物。先前的工作表明，跳虫的肠道可以被病原体定植。我们发现，在ZT暴露的跳虫中，Brevundimonas diminuta和Sphingobacterium spiritivorum ATCC 33300显著富集，这与蜜蜂的最新工作一致，表明在环境压力下，机会性细菌病原体可以在它们的肠道微生物群中富集。先前的研究指出，农药压力可能促进非靶标动物的传染病，包括可能影响人类健康的人畜共患菌株。尽管在我们的捕食性螨虫肠道中没有观察到潜在病原体的显著增加，但SourceTracker分析显示，随着ZT浓度的增加，来自跳虫的病原体比例增加了。这一观察表明， 农药暴露和压力可能加速在更高营养级别的病原体获取。

潜在病原体和ARGs的共发生（图5）表明，ZT预暴露可以富集潜在的耐药病原体。具体来说，在我们的结果中识别出了一系列潜在的ARGs病原体， 它们在跳虫和捕食性螨虫网络之间表现出不同的模式，包括网络之间共享节点的范围，包括ARGs和潜在病原体。 例如，共享的dfrA17和cmx基因在两个网络中都被发现，并且与一系列不同的病原体相关。这些多样化的基因，被分类为不同的药物抗性类型，在数百种病原体中被报道，表明 如果它们进入更高营养级别，可能会有进一步传播的风险。 共享节点表明相邻营养级别之间的抗性组和病原体的一致性。

然而，我们没有发现跳虫和捕食性螨虫网络之间的共享边，这可能是由于它们肠道微生物群的固有差异，即使一些病原体与两个网络中的多个ARGs或MGEs相关。这些病原体的同时出现表明它们可能在无脊椎动物的肠道中传播和定植。为了解决这一潜在风险， 应集中努力识别携带ARGs和MGEs的病原体宿主 ，这些病原体促进了它们的传播。 这些病原体可能“感染”不同食物链中的各种生物 ，在不同环境中传播和扩散，通过土壤生态系统传播和扩散的风险很大。 鼓励未来的研究采用基于培养的方法来探索ZT暴露前后不同营养级别之间的表型差异，特别是在携带不同MGE或ARGs的匹配病原体之间的比较。